植物组织培养过程中存在的问题及预防措施

邹 悦 刘文钰

（沈阳工学院生命工程学院，辽宁 抚顺113122）

植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，在无菌条件下将其接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。组织培养过程中常会发生一些问题，如材料污染、褐变和玻璃化等，严重影响组培效果，甚至导致组培失败。现将植物组培过程中发生问题的原因及预防措施介绍如下。

1 材料污染

材料污染指组培过程中，培养基或培养材料滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。

1.1 污染的来源

植物组培过程中，所用工具、器械和接种室消毒不严密或技术操作不标准等均会导致操作环境受污染。污染原因按病原菌种类可分为细菌类污染和真菌类污染。细菌污染主要由介质的外植体消毒不彻底且操作不当引起的，真菌污染是由超净工作台卫生不合格、无菌室空气不干净、实验人员操作不妥等引起的[1]。

1.2 污染的预防

1.2.1 环境、人员、用品的卫生要求

植物组培要求接种环境干净卫生，操作人员接种前需进行严格的卫生处理，组培过程中使用的一次性用品必须保证一用一换。

1.2.2 外植体材料要求

生长在土壤中的块根、块茎和鳞茎带菌量较多，表面积越大的外植体材料带菌量相对越多，因此应尽量选择幼嫩的茎尖、胚进行组织培养。王吉凤等[2]在芍药组织培养中发现，高温多雨的环境有利于污染的发生，最佳的取材时间为3～5月份连续晴朗的下午。

1.2.3 培养基灭菌

目前组培容器的消毒主要采用高压蒸汽灭菌法。灭菌操作时要严格遵守高压蒸汽灭菌锅的使用要求及注意事项。灭菌后需进行抽样试验培养，确保同批次灭菌培养基表面无细菌或真菌污染，以防后期发生污染造成更大损失。

2 材料褐变

培育的外植体褐变会严重影响外植体的生长与分化，甚至造成组培苗死亡，是目前植物组织培养中十分棘手的问题。

2.1 褐变产生的原因

材料褐变的原因和影响因素较为复杂，涉及外植体的选择、培养条件以及培养方式等。

2.1.1 外植体的选择

外植体的种类、取材部位、取材季节等是材料发生褐变的主要影响因素。研究表明，同一种植物，幼龄比成龄产生褐变的可能性小，取材小的外植体发生褐变可能性较大，取材季节以春秋两季较适宜[3]。

2.1.2 外植体的培养条件

消毒时间越长外植体褐变越严重，光照和高温都会加剧外植体褐变；培养基琼脂的用量越少、无机盐浓度越高，外植体发生褐变的几率越大。

2.1.3 外植体的培养方式

一般情况下，茎段正向插入培养基比反向插入培养基，外植体发生褐变的几率大；接种后放置时间越长外植体越易产生褐变。

2.2 材料褐变的预防

2.2.1 外植体材料的选用

由褐变的产生原因可知，应避免在夏季或冬季取材，宜选用大一些的幼龄外植体。若取材需求允许，尽量采集草本植物作外植体材料。

2.2.2 外植体的培养条件

外植体材料的消毒处理必须符合要求；组织培养的环境要求低温避光，以降低植物细胞中酶的活性，从而避免褐变的产生；培养基配制时适当增加琼脂用量，以降低无机盐浓度，创造酸性的培养环境。

2.2.3 外植体的培养方式

若在科学选用外植体材料、满足外植体培养条件的基础上，外植体褐变防控效果仍不理想，可在培养基中适当添加抗褐变助剂，如有吸附作用的助剂活性炭和抗氧化剂硝酸银等[4]。

3 材料玻璃化

玻璃化指在植物组织培养过程中，各种不适因素导致组培苗叶片卷曲畸形并出现嫩绿透明的现象。玻璃化普遍发生于自然界的多种植物中，会降低材料的存活能力，使其无法继续展开后续的继代、驯化、移栽及培养工作[5]。

3.1 玻璃化的成因

3.1.1 外植体材料

外植体材料的类别、取材部位以及材料的大小都能导致玻璃化发生，且显著影响玻璃化程度。一般外植体新分化、分化程度较低的组织更易发生玻璃化。

3.1.2 培养条件

培养环境温度过高、培养瓶的照光时间过长，培养材料易发生玻璃化；继代培养代数越多，玻璃化发生的几率越高、发生越严重。

3.1.3 培养基类型

提高基础培养基中的NH4+浓度，会增加组培苗玻璃化发生的可能性；植物组织培养过程中，蔗糖不仅具有维持相对稳定渗透压的能力，还有克服并减少材料玻璃化发生的作用。

3.2 材料玻璃化的预防措施

3.2.1 外植体的选用

选用植物中木质化、分化程度较高、个头较大的组织进行植物组织培养。

3.2.2 培养环境

适宜的低温环境可预防培养材料发生玻璃化；透气性好的封口材料能提高培养瓶内的通气度、降低培养瓶小环境湿度，可减少玻璃苗的发生。

3.2.3 培养基成分

减少培养基中NH4+的添加量，增加Ca2+的添加量，适当提高蔗糖浓度，适当减少细胞分裂素，可减轻玻璃化发生的程度；培养基中添加一定量的活性炭，不仅可降低培养材料玻璃化的发生率[6]，还能预防材料褐变。