238例疱疹性咽峡炎病原学特点分析

冉绍云

(郑州市第一人民医院，河南 郑州 450000)

疱疹性咽峡炎(Herpangina,HA)是较为多见的传染性疾病，以人肠道病毒(HEVs)感染为主，发热、咽痛、咽部疱疹是其主要临床表现。该病多见于婴幼儿，全年均可发生，传染性强，易爆发流行[1]。绝大部分病例症状轻微，具有自限性，但少数病例病情会迅速恶化，可发展为重症，严重时危及生命，即使存活也常会遗留严重后遗症[2]。近年来，HA在全球范围内广泛流行，国内多个城市已经发生爆发疫情[3,4]。然而，由于HA在国内并非法定传染病，相关研究报道尚少，尤其对其病原学的研究缺乏。因此，为了解本地区HA的病原学特征，本研究对238份HA粪便标本进行检测分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年2月～2018年12月由郑州市第一人民医院送检的HA病例粪便样本238份，所有标本均于冷藏条件下送检。

1.2 提取病毒RNA

以无菌棉签采集粪便样本，放置在离心管(含有Hanks平衡盐酸溶液600μL)中，再将离心管置于旋涡混合器中，予以振荡，充分摇匀，再取8 000 g离心处理5 min。采集上清液约200 mL，采用High Pure Viral RNA kit试剂盒(Roche公司)进行病毒DNA提取，严格按说明书进行操作。

1.3 RT-PCR

采用硕世公司肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16(CVA16)和EV71荧光定量PCR试剂盒进行样本RNA检测。RT-PCR反应体系：去RNA酶水3.5μL，酶混合液5μL，核酸扩增反应液7.5μL。

1.4 RT-snPCR

以逆转录试剂盒将未分型的其他肠道病毒阳性样本的病毒RNA逆转录为cDNA。行A组肠道病毒半巢式RT-PCR扩增，以HEVAS1495及HEVA2C作为首轮引物，以HEVAS1495及HEVAR2807作为次轮引物[5]。对A组肠道病毒VP1全基因筛查未能检查的样本，进一步行肠道病毒筛查，首轮引物采用224及222，次轮引物为AN89及AN88[6]。采用1.2%琼脂糖凝胶110V对RT-snPCR扩增得到的产物进行电泳，处理30min后进行观察，如检测结果和预期片段相符，则判定属于阳性。产物序列测定：(1)HEVAS1495：序列为5'-CAGTCTTCATCAGTTACCCTG-GTIATICCITGGATIAGYAACAC-3'，基因区域为VP3，位置2192-2236；(2)HEVAR2C：5'-CGGTGYTTGCTCTTGAACTG-CATG-3'，基因区域为2C，位置4409-4432；(3)HEVAR2807：序列为5'-CAGTTACACCGGGCAATCGTGT-CRCAICCYTGIGCIGTRG-3'，基因区域为2A，位置3502-3463；(4)224：序列为5'-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3'，基因区域为VP1，位置1977-1996；(4)222：序列为5'-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3'，基因区域为VP1，位置2969-2951；(5)AN89：序列为5'-CCAGCACTGACAGCAGYN-GARAYNGG-3'，基因区域为VP1，位置2602-2627；(6)AN88：序列为5'-TACTGGACCACCTGGNGGNAYR-WACAT-3'，基因区域为VP1，位置2977-2951。

1.5 生物信息学获取

行测序结果比对(BLAST工具)。行序列作剪切处理(Bioedit软件)，并行系统进化树的构建。参考毒株序列统一来源于NCBI的GenBank。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

238份HA病例标本经荧光RT-PCR检测显示，共204例肠道病毒阳性，阳性率为87.39%(208/238)；其中EV71占1.92%(4/208)，CA16占20.19%(42/208)，其他肠道病毒占77.88%(162/208)。

2.2 RT-snPCR结果

162份其他病毒阳性标本经RT-snPCR扩增，电泳显示特异性条带159份，阳性率为98.15%(159/162)。所有特异性条带均测序成功。通过BLAST对测序结果进行分析，鉴别出CA2、CA5、CA6及CA10四种病毒，分别占样本总数的21.85%(52/238)、4.20%(10/238)、29.83%(71/238)、10.92%(26/238)。

2.3 生物信息学分析

将本组测得的CA6、CA2序列和下载的参考序列(CA6序列41例，CA2序列25例)共同构建进化树，参考株序列源自GenBan。以VP1基因为基础构建进化树，结果显示，从2017年～2018年该地区HA病例中分离的CA6病毒株都属于B基因型。这和国内其他地区近年分离的B基因型较近，而和国外结果基因分属不同。序列同源性分析显示，71株CA6序列VP1区核苷酸、氨基酸同源性分别为95.8%～100%、97.5%～100%，52株CA2毒株间核苷酸及氨基酸同源性分别为91.2%～99.2%、92.6%～100%。进化树和近年深圳、上海、香港分支属于同一支，且和香港2012年的CA2流行株高度相似，核苷酸及氨基酸同源性分别为90.8%～99.7%、91.9%～100%。

3 讨论

既往报道显示，A组肠道病毒感染所致的HA症状通常较为轻微，但近年也有研究报道，该组病毒感染也会导致严重并发症，同时HA可增加手足口病聚集风险[3，7]。然而目前HA尚未受到足够重视，防控方面仍存在诸多不足。加强HA的监测对儿童健康成长有着重要意义。

本组监测的HA病例粪便标本中，共发现6种类型病变体，即CA2、CA5、CA6、CA10、CA16及EV71，它们都归属于A组肠道病毒，未发现其他组肠道病毒，与既往报道一致[8]。法国2010年的报道显示HA病例主要流行株为CA6及CA10为HA病例主要流行株[9]，泰国2012年为CA6和CA8[10]。本研究显示，CA6是导致HA发生的主要流行株，CA2次之，这可能是区域差异引起的，但柯萨奇病毒为主要病原。

本研究采用扩增VP1全序列法对HA病例中CA6遗传进化予以分析发现，CA6序列VP1区核苷酸同源性为95.8%～100%，氨基酸同源性为97.5%～100%，和国内近年报道的B基因病毒株一致性较高。CA6近年来在多个地区活跃度越来越高，逐渐成为肠道病毒的主要流行株，逐渐取得了EV71及CA16[11]。随着感染人数不断增多，肠道病毒CA6基因突变的几率也会随之增大，而随着变异的日积月累，其越可能出现爆发流行。故应加强CA6的监测。前期报道显示，CA2所致感染症状多轻微，以HA为主[4]。但香港于2012年发生了CA2感染患儿死亡的病例[12]。而本研究中CA2毒株和上述香港报道的CA2毒株属同分支，有着密切的进化关系，核苷酸同源性为90.8%～99.7%，氨基酸同源性为91.9%～100%。鉴于CA2病毒感染也可引起严重事件，故也有必要加强CA2监测。

综上所述，对于HA监测，不仅需重视EV71、CA16之外肠道病毒的监测，还需针对CA6型进行分型鉴定，并且应加强CA2重组毒株的监测，以为该地区的防控提供指导。