基于超高效液相色谱法快速测定液态奶及奶制品中AFTM1 方法的建立

□ 张胜利 晋中市综合检验检测中心

黄曲霉毒素（AFT）是粮食食品和动物饲料中常见的一类剧毒、可致癌的霉菌毒素污染物，其中AFTB1毒性最强，而哺乳动物食用被AFTB1污染的饲料后经体内羟化作用后，其乳汁及尿液中会产生AFTM1，研究表明人类当前大量消费的牛奶及其制品极易受AFTM1污染[1]。GB 2761—2017 中 规 定 乳 及 乳制 品 中AFTM1限 量 为0.5 μg/kg，GB 5009.24—2016[2]中 给 出 了ID—LC/MS/MS、HPLC 及ELISA 3 种检测方法，其中HPLC法在基层实验室应用广泛。近年来，高效液相色谱仪逐渐发展为超高效液相色谱仪（UPLC），UPLC分离度好、检测时间短、效率高、试剂消耗少。为建立超高效液相色谱法测定液态奶及奶制品中AFTM1，本文对UPLC—FLD 法测定液态奶及奶制品中的线性范围、检出限、精密度及准确度等进行了评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牛奶、酸奶（购自某超市）；黄曲霉毒素M1标准品：浙江省农业科学研究院，编号GBW（E）100419（a）；乙腈、甲醇均为色谱纯；实验室一级超纯水。

1.1.2 仪器与设备

Waters UPLC H—Class 超高效液相色谱仪（配FLD 检测器）；ME204 电子天平（精度0.000 1 g）；涡旋混匀仪；真空固相萃取装置；冷冻离心机；氮吹仪；黄曲霉毒素M1免疫亲和柱等。

1.2 试样处理方法

1.2.1 试样提取

准确称取4 g 试样于离心管中，加入10 mL 甲醇，涡旋混匀，于4 ℃下以6 000 r/min 离心10 min，将14 mL上清液置于烧杯中加40 mL 超纯水稀释，待净化。

1.2.2 净化浓缩

将冷藏的AFTM1免疫亲和柱恢复至室温，待其中的原有液体放尽后，将待净化的样液转移入免疫亲和柱内，控制样液以1 mL/min 的速度过柱，再用10 mL 超纯水以1 mL/min 流速淋洗小柱后真空抽干。准确吸取2×2.0 mL 甲醇以1 mL/min 的流速洗脱小柱并真空抽干，收集全部洗脱液于50 ℃下氮吹至近干，加入初始流动相涡旋溶解残留物，用0.22 μm 滤膜过滤后，待测。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Waters—C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温30 ℃；流动相：甲醇∶水∶乙腈=15 ∶75 ∶15（体积比），等度洗脱，流速0.40 mL/min；检测器：FLD 检测器（大流通池），λ激发=360 nm，λ发射=430 nm；进样量：3 μL；峰面积外标法定量。

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限

将AFTM1标准品按逐级稀释法配制成0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 ng/mL与5.0 ng/mL 标准工作系列液，采用上述色谱条件进行分析，以UPLC 测定的峰面积为纵坐标，相应工作系列点质量浓度为横坐标制作工作曲线，AFTM1线性回归方程为y=6.24×105x（r=0.999 9）。根据3 倍信噪比的峰响应值计算方法检出限，10 倍信噪比的峰响应值计算方法定量限，求得称样量4 g、定容体积1 mL 时该方法的检出限为0.003 μg/kg，定量限为0.010 μg/kg，检出限和定量限均优于国家标准方法。

2.2 方法回收率与精密度

向某已知含量的酸奶试样中添加不同浓度水平的AFTM1标准溶液，按照前述试样处理过程、色谱条件进行操作分析，每个浓度水平进行6次平行测定，计算加标回收率和精密度，结果见表1。本方法的回收率为93.1%～106.0%，精密度为0.99%～1.98%。

表1 加标回收率与精密度试验结果

2.3 实际样品的测定

实验中应用本方法对市售的8 份牛奶和13 份酸奶饮料进行检测，AFTM1检出率为42.86%，检出超标牛奶样品1 份。由本中心两位检验员对该牛奶样品进行人员比对试验，结果分别 为0.79 μg/kg、0.81 μg/kg，两次测定绝对差值/算术平均值为2.5%，符合标准规定。

3 结论

本方法参照国标方法，建立了UPLC—FLD 法测定液态奶及奶制品中AFTM1的方法，线性范围、检出限、精密度及准确度等均符合GB 5009.24—2016 及GB/T 27404—2008 的 规 定，能够满足液态奶及奶制品中AFTM1的准确、快速、高通量检测需求。