Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平与T1DM患者病情发生发展的关系

王智峰,李秋梅,姜 啸,徐心悦

(大连大学附属新华医院内分泌科，辽宁大连 116021)

糖尿病是临床常见的慢性疾病，其主要是由于机体胰岛素分泌不足或机体存在胰岛素抵抗而导致的代谢紊乱[1]。糖尿病又分为1型和2型，其中1型糖尿病(T1DM)多受遗传易感基因影响，其发病机制主要是自身抗原特异性、致病性T淋巴细胞攻击胰岛导致β细胞损伤而无法分泌胰岛素[2]。T1DM的临床症状主要为多饮、多食和消瘦，早期难以预测及诊断，当患者就诊时，血糖已经明显高于正常水平，胰岛β细胞受损严重，患者难以治愈，且需要长期给予胰岛素进行治疗[3]。因此，寻求特异性指标对疾病的诊断及治疗靶点的选择具有重要意义。CD4+、CD25+调节性T淋巴细胞(Treg)是机体重要的免疫调节T淋巴细胞，参与机体调控免疫应答及维持免疫自稳[4-5]。近年来有研究指出，Treg抑制功能低下及数量的降低和T1DM的发生、发展密切相关[6]。人转录因子Foxp3是Treg分化及生长的主要基因；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4)是Treg表面代表性的免疫表型[7]。T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)是一种新发现的与糖尿病进展相关的蛋白分子[8]。本研究以本院收治的T1DM患者和健康者为研究对象，比较患者Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平与健康者之间的差异，从而探讨这3种指标与T1DM患者病情发生、发展的关系，旨在为T1DM的早期诊断及治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 经伦理委员会审议并批准，将本院2017年1月至2019年7月收治的80例符合纳入及排除标准的T1DM患者作为观察组，并选取同期行正常体检的80例体检健康者作为对照组。观察组中，男45例，女35例；年龄23.5～63.2岁，平均(42.6±10.2)岁。对照组中，男42例，女38例；年龄22.8～65.3岁，平均(43.2±10.6)岁；两组受试者基线资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2纳入标准 (1)患者符合世界卫生组织糖尿病诊断标准[9]；(2)患者体内胰岛素自身抗体、锌转运体8抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体至少一项为阳性；(3)患者确诊后一直采用胰岛素替代治疗；(4)发病时患者空腹C肽<300 pmol/L；(5)受试者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.3排除标准 (1)合并严重糖尿病并发症；(2)合并心脑血管疾病；(3)合并心肝肾功能不全；(4)入组前3个月存在急性疾病、创伤或严重感染；(5)主动申请退出本研究。

1.4方法 在所有受试者入组后采集空腹静脉血3 mL两管，一管使用梯度密度离心法分离收集外周血中单个核细胞，后采用流式细胞术法检测外周血中Foxp3+Treg水平。另一管使用Trizol试剂盒提取总RNA，后采用PCR法检测其中Tim-3、CTLA-4 及β-actin mRNA水平，以Tim-3/β-actin及CTLA-4/β-actin分别表示Tim-3、CTLA-4的表达量，所用引物见表1，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，所有操作均严格遵照标准作业程序进行操作。

表1 引物列表

2 结 果

2.1两组Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平检测结果 观察组外周血中Foxp3+Treg水平明显低于对照组，Tim-3和CTLA-4水平均明显高于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平检测结果

2.2Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4水平与T1DM的关系 患者外周血中Foxp3+Treg水平与其病情严重程度呈负相关(r=-0.483,P<0.05)，Tim-3和CTLA-4水平与其病情严重程度呈正相关(r=0.518、0.502，P<0.05)。

2.3Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4诊断预测T1DM的价值 采用Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4联合检测鉴别T1DM的灵敏度、特异度及曲线下面积(AUC)均明显高于各指标单独或两项指标联合检测，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表3、图1。

表3 Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4诊断预测T1DM的价值

图1 Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4诊断预测T1DM的ROC曲线图

3 讨 论

近年来，人们生活习惯及饮食结构出现显著改变，导致糖尿病的临床发病率呈逐年上升趋势[10]。其中T1DM主要与遗传易感基因密切相关，是由致病性T淋巴细胞、自身抗原特异性等直接攻击胰岛组织并导致β细胞出现特异性损伤、胰岛素分泌量不足的自身免疫性疾病[11]。Treg属于人体内重要的表达白细胞介素(IL)-2受体α链的CD4+T淋巴细胞，其可有效抑制外来抗原或胰岛自身抗原的异常免疫反应，与T1DM发生、发展密切相关[12]。转录因子Foxp3是有效维持CD4+细胞发育和功能的重要因子，其在CD4+CD25HighTreg中特异性表达，且细胞活化方式出现改变后其水平并未随之变化，是目前公认的识别Treg的重要标志物[13]。

Tim-3是体内重要的由281个氨基酸组成的蛋白，其在多种免疫系统疾病中均呈现异常表达状态。有研究指出，Tim-3在Th1细胞中特异性地选择性表达和分化，并通过与配体的相互作用有效调节Th1免疫应答效应[14]。有研究结果显示，在糖尿病患者体内Tim-3+水平明显升高，且随着患者病情加重其水平也明显升高[15]。CTLA-4是人体内T淋巴细胞增殖活性的重要负性调控因子，有研究指出其可与B7分子特异性结合并有效抑制T淋巴细胞活化，且可有效抑制CD4+Treg细胞功能，属于必要的负性调控分子[16]。

本研究结果显示，观察组外周血中Foxp3+Treg水平低于对照组，Tim-3和CTLA-4水平均明显高于对照组。此外，患者外周血中Foxp3+Treg与其病情严重程度呈负相关，Tim-3和CTLA-4水平与其病情严重程度呈正相关。且采用Foxp3+Treg、Tim-3和CTLA-4 3项联合检测鉴别诊断T1DM的灵敏度、特异度及AUC均高于各指标单独或两项指标联合检测。分析认为，Foxp3作为脊椎动物叉头样转录因子，特异性表达于Treg，是Treg发育的关键因子，亦是Treg的特征性标志，因此，Foxp3+Treg水平能更准确地反映Treg的活性。在糖尿病前期，虽然糖耐量受损患者体内T细胞水平降低，但Foxp3+Treg水平并无改变，随着疾病的发展，患者体内可溶性IL-2受体大量聚集，导致IL-2对T细胞作用下降，影响T细胞增殖，导致Treg生成障碍，从而导致Foxp3+Treg水平降低。Tim-3及CTLA-4水平在T1DM患者体内呈现异常升高状态，其可能导致患者Th1等免疫细胞分泌大量IL-4及γ-干扰素，导致体内Th1/Th2水平失衡，进而导致患者胰岛β细胞受损，并加重患者病情。相较于各指标两两联合或单独检测，采用3项指标联合检测可更为全面地评估体内免疫及炎症状态，有助于提高鉴别诊断准确率和有效性。

4 结 论

综上所述，Foxp3+Treg与T1DM病情呈负相关，Tim-3和CTLA-4水平与T1DM病情呈正相关，且3项指标联合检测可明显提高鉴别诊断T1DM的效能。但本研究临床研究样本数较少，且并未对患者进行长期随访研究，有待后续深入研究分析。