环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在系统性红斑狼疮患者全血中的表达及临床意义①

罗 清 黄自坤 张 露 李俊明

(南昌大学第一附属医院检验科，南昌330006)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)作为常见的自身免疫性疾病，严重危害人类健康，其因机体免疫功能紊乱而产生抗双链DNA抗体(anti-double-stranded DNA antibody，anti-dsDNA)、抗Sm抗体(anti-Smith antibody，anti-Sm)等多种自身抗体，造成多个组织、器官损伤，进而出现多样化的临床表现[1]。临床研究证实，虽然目前出现新型的生物制剂和更有效的SLE治疗策略，但其缓解率仍不高，造成这种状况的原因之一是缺乏高度敏感、特异的SLE诊断方法，疾病进程监测以及治疗评价的方法。环状RNA是新发现的由外显子、内含子或两者的转录本形成的闭合环，能够耐受核酸外切酶的消化，具有良好的生物稳定性，且广泛存在于细胞内外[2]。这些特点使得环状RNA作为新型临床生物标记物成为各种疾病研究领域的新热点[3]。并且已有大量研究证实环状RNA可用于多种疾病的诊断、疗效判断、监测复发等[4-6]。而其在SLE中的所呈现的诊断效能和致病作用也逐渐被大家所认识[7,8]。在本课题组的前期研究工作中，通过采用高通量基因芯片筛查发现SLE患者全血中环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达显著升高，提示其可能作为SLE诊断标志物。因此，本研究旨在检测SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表达水平，探讨hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626以及联合这两种环状RNA在SLE诊断和鉴别诊断中的作用。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 SLE疾病组来自于2018年9月至2019年2月在南昌大学第一附属医院风湿免疫科确诊的47例初诊未用药SLE患者，其中男性5例，女性42例，平均年龄(6.42±16.68)岁，SLE的诊断依据按照美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)1997年修订的分类标准[9]，并除外其他严重疾病。正常对照组(healthy controls，HC)来自于同时期南昌大学第一附属医院进行体检的健康志愿者32例，其中男性4例，女性28例，平均年龄(42.59±13.51)岁。SLE疾病组与正常对照组年龄、性别差异无统计学意义。RA疾病对照组来自于2018年9月至2019年2月在南昌大学第一附属医院风湿免疫科确诊的37例初诊未用药类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者，其中男性6例，女性31例，平均年龄(49.81±12.78)岁，RA的诊断依据按照ACR 1987年修订的RA诊断标准，并排除其他严重疾病[10]。

1.1.2主要试剂、仪器 Trizol试剂购自Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和 SYBR®Premix Ex TaqTM购自大连宝生物 TaKaRa公司；hsa_circ_0004156 、hsa_circ_0082626及内参基因 β-actin 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度计购自美国 Nanodrop 公司；Applied Biosystems 7500 型荧光定量 PCR仪器购自美国 ABI 公司。

1.2方法

1.2.1全血总RNA提取及cDNA合成 采集SLE患者、RA疾病对照者和正常对照者空腹乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝静脉血2 ml，6 h内取250 ml全血加用750 ml Trizol试剂处理，放-80℃冰箱保存。按 Trizol 试剂说明书推荐的标准流程提取所有受试者全血的总RNA，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理过的蒸馏水溶解 RNA。取1 ml提取的总RNA，按照说明书利用 PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。

1.2.2实时荧光定量聚合酶连反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 采用TaKaRa实时荧光定量PCR SYBR Green法，按照试剂盒说明书提供的检测步骤、反应体系、反应条件进行。以β-actin基因作为内参，采用ABI7500仪器进行环状RNA水平的检测，通过熔解曲线检测环状RNA PCR产物中有无非特异性扩增。根据待测标本的Ct值，采用相对定量法对RT-PCR结果进行分析，计算2-ΔΔCt[11]。ΔCt(疾病组)= Ct(疾病组目的环状RNA)-Ct(疾病组β-actin内参基因)，ΔCt(对照组)=Ct(对照组目的环状RNA)-Ct(对照组β-actin内参基因)，ΔΔCt = ΔCt(疾病组)-ΔCt(对照组)。引物序列见表1。

1.3统计学分析 数据分析均使用SPSS17.0软件进行。正态分布数据使用采用t检验，非正态分布数据采用非参数检验。环状RNA与SLE实验室指标的关系采用Spearman相关分析。环状RNA对于SLE诊断及鉴别诊断价值的评价采用受试者工作特征(receiver-operator characteristic,ROC)曲线。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1比较不同分组全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平 采用RT-qPCR检测全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在HC、SLE疾病组和RA疾病对照组中的表达水平结果表明：全血环状RNA hsa_circ_0004156在SLE疾病组的表达水平明显高于HC和RA疾病对照组，差异具有统计学意义(U=410.5，P<0.001；t=3.2，P=0.002；图1A)；全血环状RNA hsa_circ_0082626在SLE疾病组的表达水平明显高于HC和RA疾病对照组，差异具有统计学意义(U=426.0，P=0.001；U=337.0，P<0.001；图1B)。

表1 RT-qPCR引物序列

2.2全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达与SLE实验室指标的关系 SLE患者常用的实验室指标包括血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、补体3(complement 3，C3)、补体4(complement 4，C4)、抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、anti-dsDNA、抗nRNP/Sm抗体(anti-nuclear ribonucl-eoprotein/Smith antibody，anti-nRNP/Sm)、anti-Sm、抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody，AnuA)、抗核糖体P蛋白抗体(anti-ribosome RNP antibody，anti-rRNP)、抗SS-A抗体(anti-sjögren syndrome A antigen antibody，anti-SS-A)、抗SS-B抗体(anti-sjögren syndrome B antigen antibody，anti-SS-B)，抗Ro52抗体(anti-Ro52 antibody，anti-Ro52)、抗组蛋白抗体(anti-histone antibody，AHA)，分析这些实验室指标与全血环状RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表达水平的相关性发现，如表2所示，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0004156表达水平与C3(rs=-0.333,P=0.029)呈负相关，与anti-Sm(rs=0.305,P=0.049)、 AHA(rs=0.309,P=0.047)

图1 SLE患者和对照组全血环状RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表达水平的比较Fig.1 Expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and controlsNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC；B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 was significantly increased in SLE patients than that in RA patients and HC.

呈正相关；SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0082626表达水平与C4(rs=-0.340,P=0.026)呈负相关，与AnuA(rs=0.313,P=0.044)呈正相关。此外本研究还发现，anti-Sm阳性的SLE疾病组的全血环状RNA hsa_circ_0004156表达水平明显高于anti-Sm阴性SLE疾病组(t=2.4，P=0.023)，anti-dsDNA间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法阳性SLE疾病组的全血环状RNA hsa_circ_0082626表达水平分别明显高于anti-dsDNA间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法阴性SLE疾病组(U=148.5，P=0.030；U=144.5，P=0.023)，C4降低的SLE疾病组的全血环状RNA hsa_circ_0082626表达水平分别明显高于C4正常SLE疾病组(U=105.5，P=0.030)，如表3所示。但未发现全血环状RNA hsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626表达水平与SLE的其他实验室指标相关。

2.3全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达与SLE临床表现的关系 SLE临床表现复杂、多样，分析SLE临床表现以及SLE疾病活动性评分(SLE disease activity index，SLEDAI)与全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平的关系表明(图2)，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0004156表达水平与心包炎(t=2.4，P=0.020)、贫血(t=2.0，P=0.049)、低白细胞血症(t=2.5，P=0.018)相关，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0082626表达水平与低血小板血症相关(U=119.5，P=0.050)。但并未发现全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平与SLE的其他临床表现以及SLEDAI相关。

2.4全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626对SLE诊断价值 为了评估全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626对SLE诊断价值，本文绘制了SLE疾病组区别于HC和RA疾病对照组的ROC曲线，结果如图3所示，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0004156在用于区别HC和RA疾病对照组的AUC分别为0.727(图3A)和0.750(图3B)，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0082626在用于区别HC和RA疾病对照组的AUC分别为0.717(图3C)和0.806(图3D)。以1.532为截断值，全血环状RNA hsa_circ_0004156诊断SLE疾病组与HC的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为51.06%、87.50%、85.71%、54.90%、0.386；以1.039为截断值，全血环状RNA hsa_circ_0004156鉴别SLE疾病组与RA疾病对照组的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为72.34%、70.27%、75.56%、66.67%、0.426；以1.867为截断值，全血环状RNA hsa_circ_0082626诊断SLE疾病组与HC的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为63.83%、81.25%、83.33%、60.47%、0.451；以1.387为截断值，全血环状RNA hsa_circ_0082626鉴别SLE疾病组与RA疾病对照组的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为72.34%、83.78%、85.00%、70.45%、0.561。

表2 SLE患者全血环状RNA与实验室指标的相关性分析

表3 SLE患者全血环状RNA与实验室指标的关系

图2 全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达与SLE临床表现的关系Fig.2 Correlation of expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestationNote:A.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients with clinical manifestation;B.The expression of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients with clinical manifestation.Compared to the negative group,*.P<0.05,#.P=0.05.

图3 全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲线分析Fig.3 ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 Note:A.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 in SLE patients and RA patients;C.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;D.The ROC curve analysis of peripheral blood circular RNA hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

图4 联合全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的ROC曲线分析Fig.4 ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626Note:A.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and HC;B.The ROC curve analysis of combined peripheral blood circular RNA hsa_circ_0004156 and hsa_circ_0082626 in SLE patients and RA patients.

2.5联合全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626对SLE诊断价值 联合全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626对SLE诊断价值分析发现，SLE疾病组联合全血环状RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626在用于区别HC和RA疾病对照组的AUC分别为0.757(图4A)和0.815(图4B)，均高于单项环状RNA的AUC。联合全血环状RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626诊断SLE疾病组与HC的敏感度和特异度分别为72.34%和71.88%；联合全血环状RNA hsa_circ_0004156-hsa_circ_0082626鉴别SLE疾病组与RA疾病对照组的敏感度和特异度分别为72.34%和83.78%。

3 讨论

环状RNA hsa_circ_0004156位于4号染色体，即4号染色体1902352-1920350(正链)，被 RNA 转录酶 Ⅱ 转录，其转录本有1439 nt[12]。环状RNA hsa_circ_0082626位于7号染色体，即7号染色体138758601-138774505(负链)，被 RNA 转录酶Ⅱ转录，其转录本有1564 nt[13]。目前尚未见有关环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的研究报道。本课题组前期采用高通量基因芯片筛查发现SLE患者全血中环状RNA表达谱发生了一些变化。本研究中，以变化显著的环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626为研究对象，探讨环状RNA RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE全血中的表达水平及其意义。

结果显示，相比于RA疾病对照组及正常对照组，SLE疾病组全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的表达量显著上调。ROC曲线分析环状RNA 的诊断价值发现，全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分别为0.727(敏感度为51.06%，特异度为87.50%)和0.717(敏感度为63.83%，特异度为81.25%)，而两者联合诊断的AUC更高，可达到0.757(敏感度为72.34%，特异度为71.88%)，提示全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能作为诊断SLE的潜在有效标识。进一步采用ROC曲线分析环状RNA是否能将RA患者中鉴别诊断SLE患者发现，全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626的AUC分别为0.750(敏感度为72.34%，特异度为70.27%)和0.806(敏感度为72.34%，特异度为83.78%)，而两者联合诊断的AUC更高，可达到0.815(敏感度为72.34%，特异度为83.78%)，提示全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626可能用于SLE与RA的鉴别诊断。

越来越多的研究证实环状RNA不仅可以作为SLE的诊断标志物，而且可用于评估疾病的严重程度。比如，Miao等[14]研究结果发现下调的circPTPN22与SLE的疾病活动性评分呈负相关，且经治疗SLE病情缓解后其circPTPN22的表达水平可明显上调；Li等[15]证实儿童SLE患者全血中的hsa_circ_0021372 和 hsa_circ_0075699与SLE患者的C3/C4疾病活动性指标相关；此外，Ouyang等[16]研究结果表明血浆circRNA_002453不但可以作为狼疮肾的新型诊断标志物，而且可作为狼疮肾严重程度的评价指标。本文研究也发现全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平分别与C3和C4呈负相关，还发现全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平与自身抗体的产生密切相关。进一步分析SLE患者环状RNA与SLE临床表现的关系发现，hsa_circ_0004156表达水平与SLE患者心包炎、贫血、低白细胞血症相关，而hsa_circ_0082626表达水平与SLE患者低血小板血症相关。这些结果证实了SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平与疾病的活动度和严重程度密切相关，其不仅可能作为SLE诊断及鉴别诊断指标，还可作为评估SLE疾病严重程度和活动度的指标。

需要指出的是，本文还存在一些不足：①SLE患者病例数较少，尤其是并发心包炎、贫血、低白细胞血症、低血小板血症的患者。虽然采用合适的统计学方法得出上述临床表现与全血环状RNAhsa_circ_0004156、hsa_circ_0082626相关，但后续应该扩大SLE患者样本量，尤其是并发上述症状的SLE患者，进一步证实SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626表达水平与这些临床表现的关系。②由于缺乏对照组的自身抗体、C3、C4等数据，未联合评价环状RNA+自身抗体/C3/C4对SLE的诊断价值。

综上，SLE患者全血环状RNA hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626明显升高，且与疾病活动性、自身抗体产生以及临床症状密切相关，可能作为SLE的潜在诊断及鉴别诊断标志物，同时可作为评估疾病严重程度和活动性的指标。但hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626如何调控SLE发病尚不清楚，希望通过更多的研究来探讨hsa_circ_0004156和hsa_circ_0082626在SLE中所呈现的致病作用。