miR-378初始体rs1076064多态性与中国汉族人群乳腺癌的关联研究

赵敏君，钱瑞仪，黄 鑫，杨 阳，陈科润，易 维，杨瑞卿，司马秀田

(1.四川大学华西医院 a.全科医学科；b.神经外科，四川 成都610041;2.四川大学华西临床医学院，四川 成都610041；3.乐山市人民医院 检验科，四川 乐山614000)

乳腺癌发病高居我国女性恶性肿瘤的首位，2015年新发病例约27.2万，死亡病例约7万[1]。随着筛查技术的广泛应用，乳腺癌5年生存率有所提高，但是约3-10%的乳腺癌患者在确诊时即有远处转移[2]。乳腺癌的发病与多种因素有关，包括环境因素和遗传因素等。研究组前期发现CD44相关位点rs13347多态性与乳腺癌的转移有一定相关性[3]。然而，迄今为止，其准确发病原因仍未完全阐明。

MiRNA是生物体内广泛存在的一类具有调控功能的非编码RNA分子，由基因组转录，经过miRNA初始体(pri-mRNA)、前体miRNA等步骤的加工最终形成成熟体miRNA。人类基因组中存在上千种miRNA，其中，miR-378在乳腺癌中异常高表达[4-6]。单核苷酸多态性(SNP)rs1076064位于miR-378初始体区，有文献报道该位点多态性与肝细胞癌和前列腺癌的发病密切相关[7,8]。本研究拟探讨miR-378初始体rs1076064多态性与中国汉族女性乳腺癌发病的关系。

1 材料与方法

1.1 临床样本采集

病例组：共133例，来自2013-2015年乐山市人民医院住院的乳腺癌患者。纳入标准:①女性患者;②病理组织学确诊为乳腺癌;③无合并其他部位原发性肿瘤。排除标准：①乳腺良性肿瘤；②有骨髓移植史患者。平均年龄 50.72±9.61岁。

对照组：共216例，来自同时期在乐山市人民医院体检的健康女性。排除具有乳腺癌家族史的个体。平均年龄41.21±10.13岁。

入选病例组和对照组样本均为无关汉族个体。

1.2 仪器与试剂

聚合酶链反应(PCR)扩增仪为杭州朗基科学仪器有限公司产品；Ion torrent PGM测序仪为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；台式离心机为德国eppendorf公司仪器；全基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；Taq I限制性内切酶购自美国NEB公司；扩增引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 运用试剂盒提取外周静脉血中全基因组DNA，按照试剂盒操作说明进行。运用紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度。

1.3.2基因分型 rs1076064位点PCR扩增引物如下：5’-CGGCAAAGATCACCAGAAGA-3’(上游)，5’-CAGGTGTTTGCAGGAGCAGT-3’(下游)。经过3轮PCR，电泳割胶纯化后，置于Ion torrent PGM测序仪上测序，操作步骤按照说明书进行。

1.4 统计学处理

直接计数法计算rs1076064不同基因型在病例组和对照组中的分布，运用χ2检验分析基因型分布是否符合Handy-Weinberg遗传平衡，并比较两组的相关性，以比值比(OR)和95%置信区间(CI)表示相对风险。所有数据均采用SPSS 25.0处理，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

rs1076064多态性在乳腺癌和对照组中的分布频率见表1，在共显性、显性、隐性和过显性遗传模型中，两组差异均无统计学意义(P均>0.05)。根据肿瘤大小和有无淋巴结转移进行分层分析，亦未发现rs1076064多态性与上述临床特征之间的相关性(表2和表3)。

表1 乳腺癌组和对照组rs1076064多态性比较

表2 rs1076064与乳腺癌肿瘤大小的关联

表3 rs1076064与乳腺癌淋巴结转移的关联

3 讨论

miRNA在肿瘤演变过程中的调控作用得到了广泛的认识。已经证实，乳腺癌中多种miRNA分子差异性表达，包括miR-378[4-6]。Yin等[4]报道乳腺癌中miR-378显著高表达，用于乳腺癌诊断的曲线下面积为0.807。体外转染miR-378可使肿瘤细胞获得干性特征，包括促进细胞集落形成和自我更新等[5]。异位表达miR-378可通过结合于Runx1基因3’非翻译区抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移[9]。长链非编码RNA GAS5通过靶向miR-378a-5p/Hedgehog信号通路成员SuFu促进三阴乳腺癌细胞凋亡[10]。此外，miR-378(*)通过抑制转录因子PGC-1β的两个伴侣ERRγ和GABPA的表达调节并诱导乳腺癌细胞的代谢转移，从而导致三羧酸循环基因表达和氧气消耗的减少，以及乳酸生成和细胞增殖的增加[11]。以上研究提示，miR-378有望成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

既往研究显示，位于miRNA初始体的SNP可能作为乳腺癌的生物学标记物[12,13]。例如，携带miR-125a初始体的多态位点rs12976445CT和CC基因型患者中miR-125a表达较低，而原癌基因人类表皮生长因子受体2表达较高[12]。位于miR-182初始体的多态位点rs4541843-T等位基因增加了乳腺癌的发病风险[13]。最近，有报道位于miR-378初始体的多态位点rs1076064G等位基因具有较高的启动子活性，预示着更好的肝癌预后[7]和前列腺癌疾病进展[8]。基于以上研究结果，推测rs1076064可能参与了乳腺癌的发生发展。本研究运用病例-对照研究分析了rs1076064与中国汉族女性乳腺癌的相关关系，并评估了该多态位点与乳腺癌临床特征的关联。

然而，本研究并未发现miR-378初始体rs1076064多态性与中国汉族女性乳腺癌发病、肿瘤大小和淋巴结转移存在明确的相关关系。造成该阴性结果的可能原因如下：第一，本研究纳入的样本例数较少，仅有133例乳腺癌患者，无法排除假阴性结果；第二，研究设计为病例-对照研究，无法排除入选偏倚。第三，乳腺癌的发病是多因素交互作用的结果，由于本研究是回顾性分析，未考虑环境等因素的影响。因此，未来有必要进行大样本前瞻性研究验证本研究结果。有文献显示，虽然单一的rs4245739基因分型与雌激素受体阴性乳腺癌发病无关，但是rs4245739A等位基因联合miR-184、miR-191、miR-193a、miR-378表达谱能够区分乳腺癌的肿瘤大小和淋巴结转移数目[14]，提示rs1076064多态性联合多个miRNAs表达可能作为乳腺癌的风险标记物。

综上所述，miR-378初始体rs1076064多态性与中国汉族女性乳腺癌发生和淋巴结转移无关。未来有待进一步开展不同种族的大样本验证性研究及基因-基因、基因-环境交互作用和SNP-miRNA表达谱联合分析，以期明确rs1076064- miRNAs的多因素综合作用对乳腺癌发病的影响，为乳腺癌的早期诊断及个体化精准治疗提供理论依据。