胱氨酸尿症的发病机制和基因治疗前景

王政昊，白云金，曹德宏，唐 寅，王 佳，魏武然

(四川大学华西医院泌尿外科，泌尿外科研究所，四川 成都 610041)

胱氨酸尿症是以一种尿胱氨酸重吸收障碍为特点的常染色体隐性遗传病[1]。以尿中高浓度胱氨酸为特点，其主要特征是尿液中排泄过量的L-胱氨酸和同时临床可出现复发性胱氨酸结石，70%的结石复发患者最终发展为慢性肾病，9%甚至发展为终末期肾病[2]。现有结石防治措施仅能减少或延缓复发，不能达到根治效果。因此临床急需寻求新的治疗途径。基因治疗主要是通过分子生物学技术改变缺陷基因或调节其功能从而达到治疗目的。目前在临床疾病治疗方面也已取得了突破性进展，特别是基因异常所致疾病，可起到延缓或治愈疾病的作用[3，4]。利用针对乙醇酸氧化酶的AAV8-CRISPR/Cas9载体用于高草酸尿症小鼠，可以减少草酸的产生，缓解肾脏的损伤，显著减少肾脏草酸钙结晶产生，而且没有副作用[5]。这些突破，为胱氨酸尿症基因治疗提供了可能。如能将治疗基因选择性地导入近端肾小管，纠正或弥补氨基酸转运体的功能，可达到治疗效果的同时大幅度减少治疗的不良反应。本文针对胱氨酸尿症的遗传基础和基因治疗前景做一综述。

1 胱氨酸尿症的遗传学基础

尿中胱氨酸主要是通过肾小管刷状缘的异二聚亚氨基酸转运体被重吸收。该转运体由两个蛋白亚单位rBAT 和 b0，+AT组成[6]。rBAT 由位于 2 号染色体的 SLC3A1[7]编码 (OMIM 104614)，而 b0，+AT 由 19 号染色体的 SLC7A9[8]编码 (OMIM 604144)。若基因突变可导致85%的胱氨酸尿症发生。但仍有15%的患者可能存在其他致病基因。肾小管rBAT表达具有区域性，主要在近端肾小管S3段，b0，+AT表达却与之相反，主要表达在S1段。由此可见rBAT和b0，+AT在肾小管内大部分并不协同作用，具有空间表达差异。另外，b0，+AT属于低亲和力转运体，单独存在基本丧失生理功能，只有与rBAT协同表达才具有完整的氨基酸转运体功能。推测近端肾小管S3段可能存在其他rBAT协作蛋白。近期研究发现膜蛋白AGT1/Slc7a13可能是rBAT第二转运体，主要位于S3段肾小管细胞顶膜，与rBAT构成异二聚体，功能试验证实AGT1可转运胱氨酸、天冬氨酸和谷胱甘肽[9]。虽然临床研究发现Slc7a13在胱氨酸尿症患者中突变率高，但不是胱氨酸尿症的致病基因[10]。因此，对于Slc3a1和Slc7a9基因表达正常的患者仍需进一步研究明确其致病基因。

2 肾脏基因治疗现状

肾脏解剖位置较深，组织细胞多样性以及解剖结构复杂，导致肾脏基因治疗相对滞后[11]。在肾脏疾病的基因治疗中，转染途径和载体的选择将是影响治疗效果的关键步骤。将携带目的基因的载体注入血液系统后，几乎全被肝脏和脾脏获取，很少能够到达肾脏[12]。另外肾脏本身解剖结构限制目前常用载体的应用。多数病毒载体直径在20～200 nM，大于肾小球传入小动脉直径10 nM，而且许多载体分子质量大于肾小球滤过蛋白分子质量阈值50 kDa，均阻碍了载体传递[13]。腺病毒基因转导效率较高是目前临床基因治疗常用载体[14]。全身使用时，基因基本在肝脏表达，肾脏表达很低，即使使用较高病毒量，亦不能达到有效表达量。由于病毒存在免疫原性，缩短了基因的表达时间。为了克服这些问题，目前采取两种措施：其一，修饰改装现有的病毒或非病毒载体；其二，直接靶向或局部使用载体，这种方式对于肾脏需侵袭性操作。因此目前靶向基因表达只限用与表浅组织或器官，比如眼睛或者呼吸系统。逆转录病毒可随机整合到宿主细胞且可以长效稳定表达，但并不不能转染非分裂细胞，然而肾小管细胞有丝分裂指数极低，因而逆转录病毒用于肾小管细胞转染是不可行的。

2.1 肾脏基因治疗载体传递途径现有肾脏局部导入或传递载体的方法包括：经输尿管肾盂注射[15]、肾静脉注射[16]、肾实质注射[17]和肾动脉注射[18]。目前还没有足够的证据证明何种途径能使肾脏长期有效表达外源基因。研究发现仅肾动脉传递相对具有较好的效果，能使肾小管和润细胞转导基因成功，但该技术具有操作难度。连续肾动脉泵入腺病毒，肾组织感染效果不理想，主要原因在于血液中存在免疫细胞，会限制病毒感染肾脏细胞[19]。通过肾静脉注入载体，能够少量表达在肾小球和近端肾小管，肾盂给药主要是转导进入集合管[16]，肾实质注射虽操作简单，但仅在注射点周围有所表达。而经过膀胱逆行注入腺病毒虽可以避免病毒载体进入血液循环，但效果不佳，而且可能导致肾小管损伤。

近期学者报道了一种类似于肾盂顺行造影的方法，即经过肾实质肾盂注射携带特定基因的AAV-9可以使肾小管表达[20]。手术后三月检测发现报告基因在肾皮质和髓质仍有表达，而肾小球无表达。分析发现基因有效转导主要集中在表达AQP2的集合管，也可稀疏表达在近端肾小管。该手术的优点是：所导致的出血和溶液外泄等并发症可接受，对输尿管无明显损伤，不会导致输尿管梗阻，与逆行转导外源基因效果相当。

2.2 载体修饰——携带特异性启动子为了减少不良反应发生，转染须是特异性的，要避免转染到其他非靶细胞和器官。肾脏是由很多不同种类细胞组成，基因治疗应该具有器官和细胞特异性。既往研究直接通过手术方式进行载体传递并未促进病毒感染特定细胞，因为肾脏由多种细胞类型组成。为了克服这一问题，通过修饰载体，使载体携带具有靶向性启动子，从而有望实现靶向转导。学者根据不同肾小管部位设计不同细胞特异性启动子，启动子驱动的定点表达特异蛋白可以特异性的表达在肾小管，而其他肾组织并无表达[19]，但插入肾脏特异性启动子并不能增加转导成功率[21]。值得一提的是，通过尾静脉向使用环磷酰胺的小鼠体内注入睡美人转座子可以明显的减弱转基因蛋白表达衰弱速度[21]。

2.3 超声微泡作为载体超声微泡是一种具有生物可降解性外壳包裹的不同气体形成的球状物质。随着技术的不断发展，目前其稳定性不断增加、微泡直径不断降低、生物相容性也越来越好。随着研究的深入，超声微泡技术不仅用于临床诊断，而且可以作为药物递送和基因治疗的载体。与病毒相比，超声微泡具备低免疫原性、可重复性和靶向性，并且可以保护基因不被核酸酶降解和机体清除。近年超声靶向微泡破坏技术介导的基因递送在糖尿病治疗中已经取得很大进步，并有望用于临床。

超声微泡目前仍需解决的问题是寻找保证超声微泡载体质量和提高转染效率的策略。超声微泡可以形成局部冲击波，导致细胞膜瞬间形成小孔，从而提高肾脏细胞穿透性，毛细血管通透性也增加[22]，且具有可恢复性。超声靶向微泡破坏技术介导的以超声微泡为载体的基因转染效率为40%左右。超声破坏载SDF-1微泡靶向释放SDF-1可提高肾脏SDF-1表达水平，促进移植的外源性间充质干细胞肾向归巢能力，归巢主要集中在肾小管周，有效延缓糖尿病肾病的进展[23]。超声靶向微泡破坏技术联合脂质体-辅酶Q10也可以改善糖尿病大鼠肾功能[24]。

3 胱氨酸尿症基因治疗困境

随着近些年胱氨酸尿症分子遗传机制研究的深入，基因治疗已成为可能。目前已经出现多种胱氨酸尿症小鼠模型，这为后期研究胱氨酸尿症的基因治疗提供模型。虽然基因治疗是胱氨酸尿症较为理想的选择，但仍要面临众多困难。由于肾脏结构的特异性，足细胞和肾小管细胞与血管之间存在基底膜，造成基因靶向导入的成功率大大减低。目前关于胱氨酸尿症基因治疗尚无报道。今后还需要寻求具有近端肾小管特异性的载体，同时保证高效的转染率，能够达到靶蛋白长效表达；另外，还要保证安全性，需要研制发现出无副作用、安全有效的载体。

综上所述，随着对胱氨酸尿症认识的增加和分子生物学快速发展，胱氨酸尿症基因治疗成为可能，虽然胱氨酸尿症基因治疗还无相关报道，相信基因治疗将会在胱氨酸尿症疾病的治疗中起到举足轻重的作用。