活性氮自由基在口腔中的作用及其机制

马歆茹，骆春梅，王沙沙，杜 芹

(1.遵义医科大学，贵州 遵义 563003；2.四川省医学科学院·四川省人民医院口腔科，四川 成都 610072；3.川北医学院，四川 南充 637000；4.电子科技大学医学院，四川 成都 610054，5.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041)

活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)分子家族的成员以一氧化氮为中心，包括过氧亚硝基阴离子(ONOO-)、亚硝酸根离子(NO2-)、硝酰基阴离子(NO-)、二氧化氮(NO2)和三氧化二氮(N2O3)等[1]。RNS可以介导口腔中多种病理生理反应。在生理情况下，RNS对维持口腔功能十分重要，如牙周组织中的NO可以扩张牙周组织内血管，增加局部血流，促进伤口愈合及改善皮瓣存活[2]。而在病理状态下，由感染等因素导致口腔中RNS显著升高，此时RNS虽可作为宿主非特异性免疫重要的一部分有效抵抗外界感染，但浓度过高的RNS会导致硝化应激，引起宿主细胞损伤或凋亡，介导或参与牙周炎、根尖周炎、扁平苔藓和口腔癌等疾病。本文主要介绍口腔中RNS的构成及其病理生理功能，探讨RNS对口腔健康的双重作用，为口腔疾病防治提供理论基础。

1 口腔内主要RNS的来源及作用机制

1.1 NONO广泛存在于体内各组织器官中，是一种具有生物活性的气体信号分子，它作为亲脂自由基可以通过扩散穿过细胞膜进入胞质[3]。体内的NO可以通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途径和硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径产生，其中NOS途径是产生内源性NO的主要途径。哺乳动物的NOS主要由L-精氨酸的代谢产生，分三种类型，在组织中表达不同并通过适当的刺激选择性激活，产生NO[4]。其中神经型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在短时内只能产生少量的NO，主要起调节生理功能的作用，如参与平滑肌松弛、调节血管舒张以控制血压、参与神经元发育和神经信号传递、参与组织稳态、参与学习及记忆的过程以及抑制血小板聚集等[5]。但另一种NOS，诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)往往不在健康情况下表达，而在受γ-干扰素和脂多糖等细胞因子或微生物产物诱导后的巨噬细胞中表达。iNOS被转录激活后通过催化精氨酸，可在几小时内产生大量的NO，这种过量的NO往往介导细胞毒性。

无论通过哪一种途径合成，生物系统中的NO都可以通过两种不同的信号通路发挥其生物学作用：环鸟苷3，5-单磷酸cGMP依赖性通路以及cGMP非依赖性通路。在前一种通路中，NO与可溶性鸟苷酸环化酶的血红素基团结合，激活可溶性鸟苷酸环化酶产生cGMP以及活化蛋白激酶G，在神经与血液系统中起信号传导作用。而后一种通路则是通过对半胱氨酸硫醇的S-亚硝基化以及对蛋白质、脂质和核酸的硝化，介导生物分子的化学修饰，引起细胞损伤。

1.2 ONOO-ONOO-由NO和超氧化物反应而产生，在NO和超氧化物接近等摩尔比时其产量最大，是一种比NO更稳定，且活性更强的氧化剂及硝化剂，是导致硝化应激的主要成分。

生理条件下ONOO-的产量很低，起维持生理功能的作用。与NO介导的生理作用相似，ONOO-可作为信号分子参与信号传导过程，如调节血管收缩及调节免疫功能。但在炎症等病理情况下，细胞因子或微生物刺激吞噬细胞，生成过量的的超氧阴离子(O2-)和NO，且二者发生反应生成大量的ONOO-。ONOO-能与蛋白质、脂质和核酸等大多数生物分子反应，促进生物分子氧化或硝化而导致细胞损伤。例如，ONOO-可以硝化蛋白质的酪氨酰基形成硝基酪氨酸，过量的ONOO-可以导致硝基酪氨酸在体内的积累，改变蛋白质结构与活性功能[8]。ONOO-还可以与鸟嘌呤快速反应生成8-硝基鸟嘌呤，8-硝基鸟嘌呤有潜在的致突变作用和致癌的可能性，与肿瘤侵袭和癌症患者的预后不良显著相关。ONOO-介导的生物分子的修饰在多种疾病中起了重要的作用，包括高血压、动脉粥样硬化、败血症、脓毒症、缺血再灌注损伤和神经退行性疾病等全身疾病，以及牙周炎、口腔肿瘤和辐射诱导的唾液腺功能障碍等口腔疾病[9]。

高浓度的ONOO-对真核生物和原核生物都具有强于NO的细胞毒性。组织中长时间生成适量的ONOO-也会导致细胞的大量氧化和潜在破坏，影响细胞功能及信号传导，诱导细胞死亡。除了损伤机体正常细胞外，ONOO-还能作为一种重要的抗菌剂发挥强于NO的微生物毒性作用，参与机体免疫。

1.3 NO2-体内的NO2-有三种不同的来源。第一种来源是作为ONOO-等其他RNS在体内分解生成的代谢产物。第二种来源是由硝酸盐在体内还原成亚硝酸盐：当人体食用含硝酸盐的食物后，硝酸盐经唾液腺浓缩释放进入口腔，通过口腔内硝酸盐还原菌的作用将硝酸盐还原为亚硝酸盐[6]。第三种来源为膳食摄入的亚硝酸盐。

NO2-能通过两种途径发挥细胞保护作用。在缺氧和炎症条件下NO2-含量升高，黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)发挥NO2-还原酶功能，催化NO2-还原为NO发挥细胞保护作用。除了这种途径外，在不依赖XOR的条件下，NO2-可以通过与血红蛋白反应，降低血红蛋白还原NO的能力而发挥细胞保护作用。但是NO2-也能通过衍生出多种RNS修饰生物分子，引起细胞损伤，或促进N-亚硝胺(N-nitrosamines)的形成导致炎症和癌症等病理现象。

1.4 N2O3NO能在有氧环境下与氧分子反应，自动氧化为NO2及N2O3，而N2O3可以解离生成NO+和硝酸盐。口腔微环境中的NO能通过这种方式转化为其他RNS。当体内NO的量远大于O2-时，NO与O2-反应主要生成N2O3。当体内巨噬细胞受γ-干扰素刺激后，可比受未刺激时多合成3～4倍的NO，这时NO与O2-反应主要生成N2O3。N2O3不稳定，它可以促进硫与胺的亚硝化，生成S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiols，RSNO)和N-亚硝胺。

2 口腔中RNS的生理作用

口腔中富含多种RNS，它们主要有两个来源：由NOS产生的NO衍生或源于口腔微环境中硝酸盐还原菌产生的NO2-。这些RNS不仅起调节和维持口腔生理功能的重要作用，还能在多种口腔硬软组织疾病中发挥正面作用。

从表3可以看出，合金锌粉加入量按照贫镉液钴的30倍加入，锌粉消耗量大，除钴效率不到20%，镉也并未置换出来，并未有效地解决系统钴循环、富集的问题。

2.1 抗菌RNS可以被机体的免疫系统用于防御感染，杀灭病原微生物。在机体遭受外界微生物的入侵后，微生物及其产物刺激巨噬细胞转录激活iNOS，在短时间内产生大量NO。NO可介导细胞毒性以杀伤微生物，它可以结合螯合铁池生成二硝基-铁络合物(DNICs)抑制细菌功能，还能通过与ROS的反应而增强其细胞毒性。外界微生物入侵后，吞噬细胞活化促进NADPH氧化酶活性，通过呼吸爆发产生大量的O2-。O2-不仅能在酸性条件下快速歧化生成H2O2发挥抗菌作用，还能与与NO反应生成ONOO-发挥更强的抗菌作用。口腔内的RNS能作为机体抵抗病原菌的非特异性防御机制，如iNOS产生的NO可以控制牙龈卟啉单胞菌感染，抑制根尖周细菌从而控制牙槽骨吸收的进展。而缺乏NO会加速牙槽骨的感染性吸收[10]。

在口腔中，硝酸盐还原菌产生亚硝酸盐也可以在龋病和牙周炎等口腔疾病中发挥抑菌作用。唾液中高浓度的硝酸盐有助于龋病的预防，在变异链球菌和乳酸杆菌等致龋产酸菌导致的牙齿周围的酸性环境中，亚硝酸盐被快速质子化形成亚硝酸，而不稳定的亚硝酸会歧化形成以NO为主的一系列氮氧化物，起抑菌或杀菌作用[11]。另一方面，在食用富含硝酸盐的食物后，唾液的PH会升高，抑制致龋菌的生长[12]。除预防龋病外，亚硝酸盐也能在牙周炎和口念珠菌病等口腔炎症疾病中发挥抗菌作用，炎症状态下唾液腺能分泌更高浓度的硝酸盐，增加唾液的保护潜力。这种高浓度的硝酸盐可由硝酸盐还原菌还原为亚硝酸盐，发挥抑菌作用[13]。

口腔中的亚硝酸盐可随唾液进入酸性胃环境中而发挥抗菌作用，在一定程度上防止胃肠道疾病。此外，一些口腔微生物还能通过口腔中亚硝酸盐在全身感染中发挥积极作用。副鳗链球菌及血链球菌等口腔共生链球菌在有氧条件下能主要通过丙酮酸氧化酶SpxB产生H2O2，H2O2与口腔中的亚硝酸盐反应形成ONOO-等RNS，抑制铜绿假单胞菌的生长，利于肺部囊性纤维化感染期间肺部功能的改善[14]。

2.2 调节血管舒张口腔中的亚硝酸盐进入体循环后，能转化为NO等RNS发挥一些生理作用，体循环中的NO可以通过血管舒张发挥一定的降血压作用，益于心血管健康。由于口腔内硝酸盐还原菌是产生亚硝酸盐的一个重要来源，口腔微生物群的变化会引起NO含量变化，通过调节血管舒张影响血压。因此，使用抗菌漱口水的人口腔微环境中及血浆中亚硝酸盐含量减少，使收缩压和舒张压增高[15]。

口腔软组织中NOS产生的NO通过调节口腔血流及唾液的流动，维持着口腔的生理功能。口腔组织的血液循环受nNOS和eNOS合成的NO调节，对于维持口腔健康至关重要。例如，NO调节着牙龈中的血流灌注，使血管舒张并向远端扩散，尤其是向根尖部血管扩散，对皮瓣存活和伤口愈合起积极作用[2]。适量的NO维持牙周组织的健康，在早期牙周炎中，牙周组织中的NO通过舒张血管平滑肌调节局部血流，起改善微循环的作用。

2.3 控制口腔疾病的发展以NO为代表的RNS可以控制一些口腔疾病的发展。Korde等[16]的研究表明，口腔癌组织中的NO能通过抑制或杀伤肿瘤细胞发挥一定的抗肿瘤作用，并且iNOS的上调可能会抑制口腔癌细胞的转移和致瘤性。在牙周炎及根尖周炎中，NO控制着牙槽骨吸收的进展，高浓度的外源性NO可诱导破骨细胞祖细胞凋亡，抑制成熟破骨细胞的再吸收活性而抑制牙槽骨的吸收。

3 口腔中RNS的病理作用

口腔内RNS除了发挥正面作用外也能导致多种病理状态。例如，由微生物感染产生的RNS通过靶向微生物起抗菌作用，但RNS靶向的分子部位不仅是微生物，还包括了宿主，因此RNS也会损伤宿主细胞。这种由RNS引起的生物分子修饰会导致一些病理状态，与多种口腔疾病的发生发展密切相关。

3.1 促进牙周炎的进展许多研究证实了炎症牙周组织中iNOS的活性及NO含量高于正常牙周组织，这是因为牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌和中间普氏菌等牙周致病菌能通过刺激巨噬细胞诱导iNOS表达[5，7，9]，使局部持续产生大量NO和ONOO-，ONOO-与酪氨酸反应生成硝基酪氨酸，导致牙周组织损伤。iNOS的表达及随后生成的RNS促进了牙周病的进展，造成牙周局部组织的破坏、牙槽骨吸收。如由iNOS产生的NO不仅可以通过增强破骨细胞的分化和活性，还可以和ONOO-通过激活聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]介导下游组织毒性，导致牙槽骨吸收和牙周炎中血浆外渗[17，18]。

一些外源性因素或全身因素促进了牙周炎中RNS的产生。例如，吸烟的牙龈炎患者的牙龈组织内能检测到较不吸烟的牙龈炎患者更强的iNOS表达，参与牙周病的发病机制[19]。患糖尿病的牙周炎大鼠的牙龈组织中ONOO-及硝基酪氨酸含量增高，提示糖尿病患者能通过硝化应激加重牙周病的程度[20]。

3.2 促进根尖周组织破坏来源于牙髓和根管系统的细菌感染导致根尖周聚集大量的免疫细胞，引起根尖周炎症。各种急慢性根尖周炎患者的根尖周组织中都存在着大量表达iNOS的细胞，如巨噬细胞、多形核白细胞、淋巴细胞和内皮细胞，使根尖周组织富含NO。与牙周炎中牙槽骨吸收相似，由iNOS产生的NO在炎症状态下促进根尖周牙槽骨的吸收，并且NO与O2-反应生成的ONOO-可导致根尖周组织的严重破坏。

3.3 促进口腔癌的发生由RNS导致的硝化应激是口腔癌发病的主要原因，RNS的增加导致唾液抗氧化系统的消耗减少，使氧化剂与抗氧化剂失衡，造成生物分子的氧化损伤，特别是NO介导生成的脂质过氧化物——丙二醛、氧化蛋白质和氧化DNA的形成与口腔癌的病理机制密切相关。许多研究表明，口腔癌患者唾液中RNS增加而抗氧化剂含量显著减少，且类似的氧化剂——抗氧化剂失衡也发生在口腔癌患者癌组织中及血液中，提示口腔癌患者抗氧化防御机制减少而硝化应激增加[21～23]。此外，口腔中硝酸盐还原菌产生的亚硝酸盐与胺和酰胺的反应可生成N-亚硝胺，N-亚硝胺具有很高的致癌性和致突变性，也促进了口腔癌的发生[21，22]。

3.4 参与口腔扁平苔藓的发生发展NO与口腔扁平苔藓(orallichen planus，OLP)的发生发展有着紧密联系。一些研究表明，OLP患者的唾液NO和亚硝酸盐明显增高，这可能是由于炎症状况而导致iNOS的过表达，产生了更多的NO，从而促进细胞凋亡，在OLP的组织病理学中被视为基底细胞变性[24，25]。尽管NO在OLP的发病机制中的具体作用尚不明确，但对唾液NO的测定可能对扁平苔藓的诊断、监测及治疗有一定意义。

3.5 参与Sjögren综合征的进展NO的产生也与Sjögren综合征密切相关。Benchabane等[26]的研究表明，由于IL-6和IL-17 A等炎性因子的存在，Sjögren综合征患者唾液腺组织中的iNOS被激活而产生过量NO，而过量的NO可能导致唾液腺炎性损伤和腺泡细胞萎缩。

3.6 促进唾液腺功能障碍的发生外源性辐射能促进体内RNS和ROS产生，引起一系列疾病。头颈部恶性肿瘤的患者在接受放射治疗后，唾液腺组织中会产生大量的NO与O2-，二者反应生成ONOO-造成生物分子的损伤，使这些患者易患口干症。辐射后产生的RNS可能是辐射诱导的唾液腺功能障碍的重要致病因素。

4 结语

RNS是近年来学者们研究的热点，口腔中富含多种RNS，发挥着多种病理生理作用。在正常生理情况下，RNS维持着口腔的正常生理功能，而在一些病理状态下，由于RNS的含量上升或机体抗氧化系统障碍，导致了硝化应激。RNS与多种口腔疾病的发生发展密切相关，RNS能在口腔疾病中发挥一定的正面作用：RNS可以在口腔感染性疾病中发挥抑菌作用、控制一些口腔疾病的进展以及用于口腔疾病的治疗。RNS在口腔疾病的治疗方面展现出一定的临床应用前景：NO可作为治疗一些口腔疾病的靶标，抑制NO或使NO过量产生可以作为口腔疾病的治疗策略，如使用iNOS选择性抑制剂可以加速根尖周病的愈合[27]，使用外源性NO能抑制OSCC癌细胞的增值[28]。但过量的RNS也是导致或促进多种口腔疾病的重要因素，因为RNS会导致生物分子的化学修饰并介导损伤，参与多种口腔疾病的病理过程。随着对口腔中RNS的作用机制的研究进一步深入，逐渐丰富了人们对一些口腔疾病发生发展机制的理解，为口腔疾病的预防和治疗提供了新的方向。