M_erk2-shRNA腺病毒对糖尿病神经病理性疼痛脊髓后角神经元影响

王月静，张萌，刘丹阳，李林，张宇华，李尽贺，姚宏波（通讯作者）

（1.齐齐哈尔医学院 组胚教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000，2.齐齐哈尔市第一医院 普外科，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

0 引言

近年来，由于中国经济水平不断提升，人们对高蛋白，高脂高糖的食物摄取量逐渐增多，从而导致人们饮食习惯逐渐变化。由于机器逐渐替代人工劳动，人们的劳动强度减低，诸多因素导致糖尿病发病率逐年增多。其临床表现为血糖增高，这些患者多数出现神经痛症状，他们常表现四肢疼痛及痛觉过敏，这些症状在劳累或压力增加时疼痛会加重，严重影响他们的生命质量，因此，探寻针对 DNP 的疾病靶点进行有效防治的研究极为重要。目前有研究发现，ERK1及ERK2参与疼痛反应及脊髓损伤过程[1-2]，因此我们推测ERK2与糖尿病神经病理性疼痛可能有关，本研究拟构建腺病毒携带的反义细胞外信号调节激酶（siERK2），我们研究团队将siERK2鞘内注入DNP模型鼠体内，观察其对糖尿病神经性疼痛模型鼠脊髓后角神经元的形态及凋亡率影响，为糖尿病神经病理性疼痛的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂。链脲菌素（streptozotocin，STZ；S0130）购自Abcam；凋亡试剂盒购自武汉博士德，M_erk2-shRNA腺病毒购自上海吉凯公司。

1.2 实验动物分组及造模。健康8 w龄雄性C57/BL6小鼠30只自由饮食，鼠笼干净卫生，垫料一日一换，动物在适应环境 1周后开始实验。实验均在标准清洁级动物实验室内完成。随机分三组：对照组，siERK2+DNP组（鞘内注射M_erk2-shRNA腺病毒），DNP组，各组小鼠体重18-25 g，购置齐齐哈尔医学院，动物合格证号（SCXK-2015-0001）。

1.3 DNP小鼠的模型制备。用专用饲料（高糖高脂）连续喂养1个月后开始实验，实验前禁食12 h，注射两次链脲霉素（STZ），注射剂量为30 mg/kg，第一次注射完成后，再过3天注射第二次，造模成功后测血糖（空腹），如果血糖值达到11.1 mol/L则造模成功，最后选出有疼痛并发症小鼠。

1.4 鞘内注射。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠固定后，选取进针点为L5-L6椎骨间隙，用10 µL微量注射器注入药物，当注射到蛛网膜下腔时，可出现甩尾动作及落空感。每只鼠注射2 µL，注射完毕后停留数秒，然后将针拔出，对照组与糖尿病组给予2 µL生理盐水，各组连续给药三天。

1.5 取材与固定。将各组小鼠用麻醉后取材，先将0.9%生理盐水从左心室注入体内，然后将小鼠全身注入固定液（4%多聚甲醛）后取材，切开背部皮肤后暴露脊髓，取出并置于固定液内固定保存。

1.6 细胞形态学观察法。首先将脊髓组织制成切片，干燥后脱蜡，将切片浸入二甲苯Ⅰ10 min后，再浸入二甲苯Ⅱ10 min，再浸入100%的乙醇溶液2次，每次浸入10 min，然后分别放入90%、80%、70%、50%乙醇溶液中，每个溶液浸入5 min，最后放入蒸馏水冲洗5 min。将切片进行HE染色，然后滴中性树胶封固，晾干后观察。

1.7 脊髓组织凋亡率检测。我们应用Tunel染色法进行检测，所有步骤按照说明书所说进行实验，组织染色阳性会出现细胞核棕黄色，实验结束后记录各组脊髓后角阳性细胞数，统计脊髓后角神经细胞凋亡率。

1.8 统计学分析。将数据进行统计处理（应用SPSS 13.0软件），数据统一用均数±标准差（）表示，应用的分析方法为单因素方差分析（ANOVA），当P＜0.05时，组间及组内差别有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色法。与对照组比较，DNP组脊髓后角细胞数量减少，细胞排列不整齐，细胞出现核固缩及坏死，与DNP组比较，siERK2+DNP组小鼠脊髓后角细胞数量较多排列相对规则，结果显示下调ERK2表达对脊髓后角神经元有保护作用。

2.2 细胞凋亡实验。各组凋亡率结果分别为：对照组（1.92±0.51），siERK2+DNP组（2.17±1.39），DNP组（3.76±1.04），与对照组比较，DNP组小鼠脊髓后角神经元凋亡率减显著增多（P＜0.05），与DNP组比较，siERK2+DNP组小鼠的脊髓后角细胞凋亡数量显著减少（P＜0.05），推测下调ERK2表达可以降低脊髓后角神经元的凋亡率。

3 讨论

DNP是糖尿病常见并发症之一[3]，一般急性发病的患者半年内症状可逐渐减轻，随着病情不断发展，多数患者急性期的疼痛会发展为慢性神经病理性疼痛。这些症状会伴随患者多年，严重影响患者生命质量，其发病机制与神经系统（包括中枢与外周神经系统）敏化有关，而引起神经系统敏化的原因有多种，如神经纤维变性，炎症反应，脱髓鞘等，DNP成为当今的研究热点，但其病因及发病机制非常复杂，因此，找到有效的靶向药物会给患者和家属带来福音。DNP发病机制至今不完全明了，其发病情况与高血糖有关，血糖升高可引起神经营养障碍，此外，它会引起神经系统代谢紊乱，而在整个的DNP发病过程中，凋亡机制参与其中。凋亡的过程是机体自我保护的过程，通过一系列程序时损伤神经元被消除，因此我研究团队应用TUNNEL染色法观察各组细胞凋亡率变化，进一步讨论ERK2对DNP小鼠模型的作用。

DNP的作用机制较复杂，其中抗炎因子，神经与信号通路分子的变化与其发病密切相关，其中MAPKS信号通路在DNP发病过程中起关键作用，ERK是MAPK家族中的一员，最近研究发现，该通路与疼痛相关的痛觉过敏有关，又有研究发现，ERK1与ERK2在糖尿病模型鼠中表达都显著增多，最近应用腺病毒为载体，调节内源性分子表达可对疼痛有治疗作用[4-5]，因此，我们选择ERK2作为治疗靶点观察鞘内注射M_erk2-shRNA腺病毒后对DNP模型鼠影响，观察下调ERK2表达后，DNP组脊髓后角神经元形态及凋亡率改变，我们发现给药组小鼠脊髓后角细胞凋亡率下降，与我们预测相符，鞘内注射M_erk2-shRNA腺病毒对DNP小鼠脊髓后角神经元有保护作用。