细胞移植及3D细胞培养技术在脊髓损伤修复中的研究进展

杨鑫，石欣，许南，舒钧

（昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明）

0 引言

一般而言，外伤所致的脊髓损伤除了脊髓发生的原发性创伤外，还会引发一系列级联的继发性损伤。其损伤部位由原发的受损区域向其头尾两端方向不断扩展。在SCI发生后，由于缺血及免疫炎症反应等事件的发生，损伤部位的神经元、轴突、少突胶质（前体）细胞（OPCs， Oligodendrocyte Precursor Cells）、髓鞘的数量减少，之后由于以星形胶质细胞为主的细胞增殖，纤维瘢痕开始形成，成纤维细胞来源的某些细胞对损伤中心进行填充。在这一过程中，会导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍，并引发一系列与此相关的临床症状，如肢体运动感觉障碍、瘫痪等，以及由此引起的如褥疮、肺部感染等能够严重影响患者生活及心理健康的并发症。目前已有大量的基础研究表明了细胞移植治疗脊髓损伤的有效性，也有许多学者及骨科医师开展了细胞移植修复脊髓损伤的临床研究。本文就细胞移植修复脊髓损伤的机制、目前常用的移植细胞、细胞联合移植的配伍方案以及三维（3D）细胞培养技术在脊髓损伤修复中的最新应用进展予以综述。

1 细胞移植修复SCI的机制

当前细胞移植修复脊髓损伤的机制中，通常以五个机制最为常见：神经保护、免疫调节、轴突再生、神经传递形成、髓鞘再生[1]。移植细胞能够介导营养因子及细胞因子等生物活性因子分泌，并且通过防止血管损伤、改善损伤区域血流供应来对神经进行保护。炎症反应对脊髓损伤的修复既有有益的一面也有有害的一面，移植细胞可以通过免疫调节，减弱有害的炎症反应或刺激有益的炎症反应。同时，由移植细胞组成的“桥”形成，能够穿过病灶部位，为轴突生长提供基质。当移植的细胞能够分化、成活并且与宿主神经元间有轴突生长和形成突触时，神经传递则能够形成。脊髓损伤时，脱髓鞘会破坏传导，而细胞移植能够促进髓鞘再生，这被认为可以改善脊髓损伤后的恢复。目前，细胞移植一直是脊髓损伤治疗研究的热点，有大量研究文献认为细胞移植对脊髓损伤修复有效。

2 细胞移植及细胞联合移植

2.1 细胞移植

当前被广泛研究的移植细胞主要包括：施万细胞（SCs，Schwann Cells），神 经 干 细 胞 和 祖 细 胞（NSPCs， Neural Stem/Progenitor Cells），少突细胞前体细胞（OPCs），嗅鞘细胞（OECs，Olfactory EnsheathingCells）和间充质干细胞（MSCs， Mesenchymal Stem Cells）。其中： （1）施万细胞能够分泌大量的神经营养因子及胞外基质蛋白，这对轴突生长起着重要的作用[2]，施万细胞移植可以对损伤脊髓的周围组织起到神经保护作用，减小病变空腔，并且可以促进轴突生长入病变损伤部位以及促进再生轴突的髓鞘形成。然而其在体外培养纯化效率仍较低，但近期也有大量关于施万细胞的培养和纯化的研究，提供了更加简单便捷的方法来培养、保存施万细胞[3]。（2）神经干细胞和（或）祖细胞（NSPCs）：具有多分化的潜力，可以在体外分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞，移植脊髓神经干细胞和（或）祖细胞能促进大鼠脊髓损伤后早期功能恢复[1]，但其移植后在宿主体内存活率较低。（3）少突细胞前体细胞（OPCs）： 是脊髓损伤后替代损伤区域中少突胶质细胞的潜在来源，能够有潜力分化为有髓鞘的少突胶质细胞。其增殖、迁移和分化受到许多因素的影响，如神经递质、生长因子、神经营养因子和转录因子等的影响。也有研究表明OPCs可能在促进胶质瘢痕形成过程中发挥作用，可能会抑制轴突再生[4]。（4）嗅鞘细胞（OECs）：是能够支持嗅觉感受器轴突生长进入嗅球的一种神经胶质细胞。在脊髓损伤区域能够与胶质瘢痕发生相互作用，分泌大量细胞因子和神经营养因子刺激血管增生、促进轴突生长及髓鞘再生，从而在脊髓损伤的修复中发挥作用[5]。（5）间充质干细胞（MSCs）： 具有多分化和免疫调节的潜力，主要通过旁分泌[6]的方式调节及缓解脊髓损伤区域的微环境，有利于神经保护、轴突再生及髓鞘形成，Kim等人[7]在急性脊髓损伤的大鼠模型中移植入MSCs，发现在MSCs移植后，脊髓损伤大鼠模型的I L-1α，CXCL-2，CXCL-10，TNF-α和TGF-β表达降低，结果表明MSCs移植通过减少炎症反应、促进星形胶质细胞增生、减少瘢痕形成，从而改善大鼠脊髓损伤后的功能恢复。

脊髓损伤修复的几个机制不是单一存在的，他们之间有着复杂而紧密的联系。上述几种类型的细胞，其各有其自己的特点，各有其优势及劣势。有的细胞 （如MSCs） 具有改善微环境的作用，然而其移植后分化为神经元的能力较低；有的细胞在移植后存活率较低；有的细胞移植后可能会抑制轴突再生。虽然有许多单独类型细胞移植已经在许多研究中被证明对脊髓损伤修复有效[8-11]，但现在也有许多研究，根据脊髓损伤后的病理生理学特点、脊髓修复机制、各类移植细胞的不同特点、各类细胞的不同来源等方面进行综合分析考虑后，选择其中几类细胞进行联合移植，结果表明可能会带来更好的治疗效果。

2.2 细胞联合移植

2.2.1 NSPCs和OECs联合移植

NSCs能够分化为神经元及神经胶质，然而在移植后其在宿主内存活率较低，而OECs能够分泌大量的生长因子，包括血管内皮生长因子（VEGF， Vascular Endothelial Growth Factor）、脑源性神经生长因子（BDNF， Brain Derived Neurotrophic Factor）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF， Glial-cell-line Derived Neurotrophic Factor）、神经生长因子（NGF， Nerve Growth Factor）等，这为NSCs移植细胞提供了良好的生长分化微环境，这两类细胞联合移植，可以增强移植物的生存能力及提高功能恢复能力。Wang等人及Ao等人的研究[12,13]表明除了NSCs具有分化潜能以外，OECs可以帮助神经元轴突穿过胶质瘢痕促进脊髓损伤的功能恢复。NSCs和OECs的联合移植优于NSCs或OECs的单一移植物。Guo等人[14]应用高温预处理NSCs及OECs细胞并在脊髓损伤大鼠中进行联合移植，结果能够使脊髓损伤大鼠的BBB评分迅速增加。

2.2.2 MSCs和NSPCs联合移植

MSCs具有免疫调节的能力，康健等[15]阐述了BMSCs具有的免疫调节能力，将BMSCs移植入SCI受损部位后能够减轻该患处的免疫炎症反应。同时，BMSCs能够分泌大量的营养因子，改善损伤区域微环境，增强NSCs的存活能力，改善其功能恢复。Hosseini等人的研究[16]提示MSCs及NSCs联合移植降低了细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活性，减少了促抗炎细胞因子IL-1β和IL-6。与单独移植做对比，能够显著改善神经功能。Stewart等人的研究[17]表明此两种类型细胞联合移植可以增加受损区域附近的轴突密度，改善模型动物的运动功能。

2.2.3 MSCs和OECs细胞联合移植

对于MSCs而言，由于其具有分化为神经元以及在体外能快速增殖的能力，MSCs可作为细胞移植疗法的“种子细胞”。这些“种子”具有很强的可塑性，可在微环境中被转化，从而分化为特定的神经元来替代受损的神经元。OECs可作为也能够成为一种治疗脊髓损伤合理的治疗策略[18]。对于OECs而言，由于其具有改变中枢神经系统微环境的能力，在MSCs和OECs细胞联合移植疗法中，可充当“土壤细胞”的作用，分泌多种神经营养因子，为受损区域的神经细胞及移植细胞提供良好的微环境，充当“土壤”的作用。赵廷宝等人的临床研究中[19]，将自体MSCs和异体OECs联合移植入受试患者的受损脊髓中，术后的随访中发现有1例患者的神经功能有所恢复，所有接受治疗的患者没有出现不良反应。

2.2.4 NSCs和施万细胞（SCs）联合移植

如前所述，由于施万细胞能够分泌大量的神经营养因子及胞外基质蛋白，改善移植细胞生长、分化的微环境，因此施万细胞能够提高NSCs的存活率，并促进其分化为神经元，且能够分泌更高水平的神经营养因子[20]。Xia等[21]使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架培养NSCs和施万细胞，并将其植入大鼠脊髓内，结果提示NSCs可以存活，并且施万细胞能够促进其存活并向脊髓内神经元分化。促进髓鞘形成、有限的轴突再生及运动功能恢复。

2.2.5 OPCs和施万细胞（SCs）联合移植

施万细胞能够促进OPCs的存活、增殖、迁移以及功能修复。OPCs和施万细胞联合移植能够促进脊髓损伤区域的髓鞘形成和组织修复。Xie等[22]使用过表达髓磷脂基因调节因子（MRF）的OPCs和施万细胞联合移植，结果表明在SCI后，OPCs和SCs联合移植能够通过增加髓鞘形成和促进组织修复来改善脊髓损伤大鼠模型的神经功能。

虽然大量的细胞联合移植实验提示联合移植能够为脊髓损伤修复带来更好的效果，但其安全性（如：在Stewart等人进行的实验中[17]，细胞联合移植治疗后，虽然脊髓损伤大鼠的轴突密度增加、运动功能有所改善，但其中一些实验动物在联合移植后出现肿瘤，而单独移植组并没有出现肿瘤）、可行性仍然值得进一步的研究，移植物配伍策略的制定仍需要在进行更大量、更规范的基础实验、动物实验及循证分析之后再进一步进行分析考量。

3 三维细胞培养技术在细胞移植治疗脊髓损伤中的应用

由于三维（3D）细胞培养技术在生物技术的应用中具有不菲的潜力[23]，现在该技术正越来越受到科学界的关注。当前，三维（3D）细胞培养技术在各个研究领域中都有大量的应用。细胞是存活于三维的微环境之中的，与传统的二维（2D）细胞培养相比，三维细胞培养能够更好地模拟体内细胞生长的自然环境，为细胞提供良好的生理微环境。因此，三维（3D）细胞培养技术为研究细胞-细胞、细胞-微环境之间的相互作用提供了强力的基础。总的来说，目前常用的3D培养支架材料大致可分为天然材料（如胶原、透明质酸、纤维蛋白等）、合成材料（聚乳酸、聚己酸内酯、聚乳酸-羟基乙酸等）及新型复合材料（天然材料之间复合或天然材料与合成材料复合等）三大类[24,25]。在三维培养支架中，使用三维细胞培养系统（如旋转式细胞培养系统、搅拌式生物反应器、灌注生物反应系统等[26,27]），能够模拟细胞生长的三维微环境。这为动物疾病模型的研究、干细胞培养技术的发展等都奠定了坚实的基础。

在干细胞移植治疗脊髓损伤的研究中，三维（3D）细胞培养技术也被越来越多地应用。该技术能够为移植细胞提供更好的培养条件，能够充分发挥移植细胞的优点，为受损区域的脊髓提供更优质的移植细胞，从而为受损脊髓提供更加良好的修复环境。现已有大量体内、体外实验、动物实验表明比起传统的二维（2D）培养，三维（3D）细胞培养技术对SCI后的脊髓损伤有更优的修复作用。例如BD PuraMatrixtai肽水凝胶等三维细胞培养模型已经被用于组织再生修复，可能在脊髓修复中起到重要作用[28]。Mauri等[29]研究了神经干细胞（NSCs）在水凝胶系统（3D支架）中的增殖和粘附情况，能够提高NSCs的存活能力。也有许多学者应用三维细胞培养技术进行了动物实验，如Han等人[30]在3D胶原支架中培养骨髓间充质干细胞（BMSCs），并将其移植入大鼠受损脊髓内，结果与普通2D培养的BMSCs相比，3D BMSCs能够显著降低TNF-α，IL-1β，IL-6等炎性细胞因子的表达，明显促进轴突再生及改善运动功能。Amanda等人[31]使用自组装肽（SAPs， Selfassembling Peptides）水凝胶，使用三维培养技术，在无血清条件下培养人神经干细胞（hNSC， human neural stem cell），使其在体外分化培养成为成熟、活跃的人神经元。并在该实验中证明了其在大鼠损伤脊髓中的功能性神经再生潜能。大量的实验表明3D细胞培养技术有潜力在脊髓损伤修复的治疗上发挥重要的作用。

目前三维细胞培养技术在脊髓损伤修复的研究中取得了有希望的结果，也为进一步探索脊髓损伤机制、细胞移植疗法治疗SCI的修复机制等机制研究开创了新的可能。但在未来，在这项技术进入临床试验之前，其仍需要通过中型动物模型实验和其他更加完善的行为学研究来得到更加确切的效果及更加安全的保障。

4 小结

由于脊髓损伤后的病理生理机制、受损脊髓修复机制非常复杂，患有脊髓损伤的患者的治疗、康复一直都非常困难，是世界范围内的一个医学难题。随着对干细胞研究的深入、细胞培养技术和组织工程学的发展、细胞移植相关研究的开展。大量的研究证明细胞移植能够修复脊髓损伤，结合细胞培养新技术以及生物高分子材料，细胞移植物的培养、分离纯化方法也日新月异。细胞移植有很大潜力成为修复和治疗脊髓损伤的一种有效治疗方法。现虽然已进行了大量的动物实验，一些临床试验也正在进行，但是细胞移植疗法要真正应用于患者身上并产生显著效果，改善患者生活水平，仍然需要很长的路要走。治疗的安全性、可行性也需今后大量的、更加深入的研究来进行论证。新型生物材料的开发研究，以及面对一系列生物材料的种类，其在细胞移植疗法中的选择、配伍方面，仍需要生物学家、生物化学家、骨科及神经外科医师之间的通力协作。