一株鸭源贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及药敏试验

张小波， 温贵兰*， 张喜懿， 陈 广， 杨 颖

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是由Cristina Ruiz-García等[1]在2005年分离并命名的菌种，广泛存在于自然界中。王金燕等[2]在刺参池塘中分离出1株贝莱斯芽孢杆菌，并对其进行了安全性试验，结果表明刺参状态良好，采食正常，无其他异常反应。连彩等[3]认为，不同贝莱斯芽孢杆菌菌株的形态与理化特征不尽相同，作为芽孢杆菌的1个新菌种还有待继续研究。近年来由于某些芽孢杆菌的营养特性及耐受特性等有益于动物肠道健康和促进消化，被作为1种益生菌而广泛应用于禽业及水产等养殖业。本试验在分离致病菌时偶然从发病花边鸭肝脏组织中分离到1株芽孢杆菌，通过16S rRNA序列分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，并进行药敏试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病鸭来源花边鸭4只，来自贵州省遵义市某养鸭场。

1.1.2 主要试剂LB固体培养基、革兰氏染料、抗菌药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司)，新生胎牛血清(购自海博生物有限公司)，2×EsTaqDNA 聚合酶(购自康为世纪有限公司)，DL 2 000 Marker[购自宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养及形态观察无菌操作从病鸭肝脏、脾脏取样，用接种环接种于LB固体培养基，37 ℃培养12～24 h，挑取优势单个菌落进行纯培养[4]。挑取纯培养菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察分离菌形态特征。

1.2.2 分离菌16S rRNA PCR扩增及测序以分离纯化后的菌液为模板，使用细菌通用16S rRNA引物进行PCR扩增。上游引物F：5’-AGAGTTT GATCMTGGCTCA-3’；下游引物R：5’-TACG GYTACCTTGTTACGACT-3’。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(预扩增片段1 450 bp)。PCR反应体系25 μL：2×EsTaqDNA 聚合酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，菌液2 μL，dd H2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。将所测分离菌的16S rRNA与GenBank数据库的参考菌株16S rRNA (见表1)进行BLAST同源性比对，利用生物学软件Megalign构建系统进化树。

表1 参考菌株信息

1.2.3 分离菌药敏试验取菌液100 μL用无菌棒均匀涂抹于LB固体培养基中，根据临床常用抗生素选定24种药物(多粘菌素B、红霉素、环丙沙星、复方新诺明、苯唑西林、氨苄西林、米诺环素、头孢呋辛、头孢他啶、克林霉素、头孢拉定、青霉素、氧氟沙星、丁胺卡那、诺氟沙星、头孢哌酮、卡那霉素、麦迪霉素、万古霉素、哌拉西林、羧苄西林、多西环素、四环素、庆大霉素)将药敏纸片紧贴于培养基上，37 ℃培养24 h，记录抑菌圈直径，参照《抗菌药物敏感试验标准》(WS/T 125—1999)进行药物敏感性判断。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化及形态观察经纯培养后，在接种肝脏组织的LB固体培养基长出乳白色、不透明、中等大小、表面粗糙、边缘不光滑的黏液样菌落；染色镜检分离菌为革兰氏阳性短小杆菌。

2.2 分离菌16S rRNA PCR扩增及测序用细菌通用16S rRNA引物对分离菌进行PCR扩增，出现1 450 bp左右目的条带(见图1)，经测序后拼接长度为1 460 bp；系统进化树分析显示其与贝莱斯芽孢杆菌处于同一分支，与大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌相距较远(见图2)。由此鉴定分离菌为贝莱斯芽孢杆菌(命名为GZZY2019)。

2.3 药敏试验应用纸片法对分离细菌进行药物敏感试验，从表2可见：该菌对红霉素、环丙沙星、复方新诺明等15种药物敏感，对丁胺卡那、哌拉西林、四环素3种药物中敏，对多粘菌素B、苯唑西林等6种药物耐药。

表2 分离菌药敏试验结果

3 结论

本试验从发病花边鸭肝脏组织中分离的细菌经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(命名为GZZY2019)，可作为动物源贝莱斯芽孢杆菌菌株的后续相关研究素材。

4 讨论

某些芽孢杆菌具有改善动物肠道微生态平衡、促进动物生长、提高免疫力和减少相关疾病等多重益生功效，是目前动物饲料中应用最广泛的1种益生菌[5]。本次分离的鸭源贝莱斯芽孢杆菌按临床常用的24种抗生素进行药敏试验显示对多粘菌素B、苯唑西林等6种药物耐药，对其他抗生素都有不同程度的敏感性。已有研究表明芽孢杆菌类的地衣芽孢杆菌对常见的多种抗生素均敏感，可避免动物体内微生物之间抗生素抗性的转移，因而减少部分微生物对其产生耐药性[6]。也有研究表明贝莱斯芽孢杆菌通过分泌脂肽类抗生素、聚酮类化合物和抗菌蛋白等产生很好的抑菌作用[7]。本次分离的鸭源贝莱斯芽孢杆菌GZZY2019菌株是否也有类似作用以及是否为致病菌株尚需进一步研究。