猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染病例的实验室诊断

张倩倩， 杨 鹏， 陈 静， 尹德晶， 程振涛*

(1. 贵州省铜仁市万山区饲料监测与药政监察站，贵州 万山 554200； 2. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

2020年3月，贵州省仁怀市某养殖场仔猪陆续出现不明原因死亡病例，病猪初期出现食欲减退、消瘦、生长缓慢、喘气、咳嗽等症状，随后发生急性死亡。该场共有仔猪600余头，1个月内相继发病仔猪20头，死亡16头，发病率3.33%(20/600)，病死率80%(16/20)。为了查明病因，特进行实验室病原学检测诊断。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集2头病死仔猪的新鲜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结作为检测病料。

1.2 主要试剂及仪器(1)主要试剂：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用型实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、猪瘟病毒(CSFV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨公司)，DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker试剂(购自大连宝生物工程有限公司)，鲜血营养琼脂培养基(购自杭州微生物试剂有限公司)。(2)主要仪器：荧光定量PCR仪Line-genek(购自杭州博日科技有限公司)、电泳凝胶成像仪SYGENE(购自Gene公司)。

1.3 细菌分离培养无菌操作取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏新鲜组织样品，分别划线接种鲜血营养琼脂培养基，37 ℃ 培养24 h，观察细菌分离培养结果。

1.4 组织样品DNA、RNA提取取肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结病料各1 g于灭菌研钵，加入生理盐水1.5 mL 快速研磨，匀浆后转入1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min 离心2 min，取上清液100 μL，按说明书方法用DNA/RNA试剂盒室温环境提取总DNA和RNA。

1.5 相关病毒核酸检测

1.5.1 PRRSV核酸检测以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系25 μL：无菌无核酸酶水5 μL，RT-PCR反应液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，荧光探针4.5 μL，模板RNA 2 μL。反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环，在每次循环第2步收集荧光信号。根据阳性对照标准，以Cq值≤35并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.5.2 CSFV核酸检测以提取的总RNA为模板，构建RT-PCR反应体系25 μL ：无菌无核酸酶水7.1 μL，RT-PCR反应液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，荧光探针2.4 μL，模板RNA 2 μL。反应条件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环，在每次循环第2步收集荧光信号。根据阳性对照标准，以Cq值≤30并出现特定的扩增曲线判定为阳性。

1.5.3 猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸检测以提取的总DNA为模板，采用PCR方法进行PCV-2检测。PCR扩增体系25 μL：2×TaqMixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物(PCV2-P1：5’-AAGGGCT GGGTTATGGTATG-3’；PCV2-P2：5’-CGCTG GAGAAGGAAAAATGG-3’)各1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌双蒸水8.5 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35次；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳(110 V，25 min)，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段353 bp)。

2 结果

2.1 细菌分离培养2头仔猪各组织样品中均未分离到细菌，表明无细菌感染。

2.2 PRRSV核酸检测由图1可见：阳性对照Cq值为11，而2份检测样品Cq值均<35且有明显扩增曲线，表明组织样品中存在PRRSV感染。

2.3 CSFV核酸检测由图2可见：阳性对照Cq值为20，而2份检测样品Cq值均>30，且无明显扩增曲线，说明组织样品中不存在CSFV感染。

2.4 PCV-2核酸检测由图3可见：2份检测样品PCR扩增均出现353 bp 目的基因片段，与阳性对照相符，表明存在PCV-2感染。

3 结论

通过对病死仔猪病料进行细菌分离鉴定和相关病毒核酸检测，确诊该猪场病例存在猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型混合感染。

4 讨论

由PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是1种急性高致死性传染病，主要引起母猪繁殖障碍、仔猪肺炎等[1]。PCV-2是圆环病毒科，圆环病毒属的1种无囊膜、共价闭环单股DNA病毒(ssDNA)，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征以及生殖系统疾病[2，3]。近年来，猪的疫病日趋复杂，混合感染也越来越普遍，尤其是PRRSV、PCV-2混合感染最为严重[4]。Pallares F J等[5]对369份临床PMWS病例进行病原分析显示，PRRSV与PCV-2混合感染率达到51.9%，只感染PCV-2的病例仅占1.9%。贾赟等[6]对来自华东地区4省市的67份PCV-2阳性病料进行检测，发现较严重的二重感染，其中PRRSV与PCV-2二重混合感染占样品总数的52.3%。罗黛青[7]检测发现，云南省东川地区猪疫病的单纯感染情况越来越少，混合感染越来越多，CSFV和PRRSV混合感染呈上升趋势。由此可见，猪群中PRRSV与PCV-2的混合感染已非常普遍，已成为严重危害猪群的混合感染性疫病。PCV-2和PRRSV均属于免疫抑制性病毒，猪群感染后免疫系统受损，免疫机能下降，二者的协同并发加重了猪免疫机能下降的程度，易造成其他疫病的继发感染，严重影响生猪生产[8]。