亚硝酸钠-硝酸铝比色法检测黔中金荞麦黄酮含量的分析试验

薛 红， 邓 蓉， 徐忠惠， 张定红

(1. 贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005； 2. 贵阳市白云区农业水利局，贵州 贵阳 550002)

金荞麦具有抗菌、抗感染、解热抗炎、抗血小板聚集、抗突变、提高巨噬细胞的吞噬功能以及抗肿瘤等多种生物活性，这与金荞麦中含有黄酮类化合物，如芸香甙、山茶酚-3-芸香糖苷、槲皮素、槲皮素芸香糖苷-7-半乳糖苷等有关[1]。黄酮类化合物是植物的重要次生代谢产物，为1类重要的天然有机化合物，能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用[2]。目前黄酮的分析方法主要包括液相色谱法和分光光度法，其中分光光度法操作简单、快速、成本低，应用广泛[3]。测定黄酮的分光光度法主要有 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、NaNO2-AlCl3-NaOH显色法和AlCl3-KAC法[4]。因黄酮的基本结构是A环和C环、B环和C环2个共轭体系，紫外光对这2个共轭体系的吸收较明显。黄酮类化合物的紫外光谱图上主要有2个吸收带：环肉桂酰系统引起的吸收带 Ⅰ (300～550 nm)和吸收带 Ⅱ (240～280 nm)。若检测过程中加入铝盐，则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物，吸收带Ⅱ会明显向长波方向移动，且在NaNO2强碱作用下，其在510 nm处吸光度值最大，这为分光光度法测定黄酮类化合物提供了依据。“黔中金荞麦”是贵州省畜牧兽医研究所于2019年育成的国审牧草新品种，现已广泛栽培并应用于我省六盘水、大方、黔西、威宁、息烽、贵阳等10余个地区的生态畜牧养殖上，并取得一定成效。为检测黔中金荞麦植株不同部位的黄酮含量，特开展此项检测分析试验，为合理开发利用该药饲兼用新型牧草提供科学依据。本试验借鉴郭欣慰等[5]对辐射诱变育成新品种“金荞1号”(京品鉴药2012021)利用芦丁测定其总黄酮的含量，同时参照行业标准《荞麦及其制品中总黄酮的测定》(NY/T 1295—2007)，采用NaNO2- Al(NO3)3(亚硝酸钠-硝酸铝)比色法进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料2020年6月采收种植于贵州省畜牧兽医研究所麦坪试验基地的三年生黔中金荞麦全植株；芦丁标准品购自贵州迪大生物有限公司。

1.2 主要试剂及仪器(1)主要试剂：芦丁标准品、30%乙醇、亚硝酸钠(NaNO2)、硝酸铝[Al(NO3)3]。(2)主要仪器：UV-2600 分光光度计(日本岛津公司)、ME104 电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)、PHS-3C 型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备精确称取芦丁标准品0.020 g，置于5 mL烧杯中，先用无水乙醇5 mL溶解，再用30%乙醇定容至100 mL容量瓶中，摇匀，即得芦丁标准溶液0.20 mg/mL。

1.3.2 绘制芦丁标准曲线用移液管分别吸取芦丁标准溶液1、2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶中，用30%乙醇稀释至10 mL(同时作空白对照)，加入5% NaNO2溶液0.7 mL摇匀，立刻加入10%Al(NO3)3溶液0.7 mL摇匀，放置5 min，加入4% NaOH溶液5 mL，用30%乙醇定容，混匀后放置5 min，即获得浓度为0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160 mg/mL系列标准溶液，并在波长510 nm处测定其吸光度值(D510 nm)。以浓度为横坐标(x)，吸收度为纵坐标(y)绘制标准曲线，得出回归方程。

1.3.3 检测样品的制备和测定分别称取金荞麦叶、茎、全株、根各100 g，在 60 ℃下烘干至恒重，粉碎后过40目筛，准确称取各样品干粉0.3～0.4 g置于150 mL具塞三角瓶中，加入30%乙醇30 mL于65 ℃恒温水浴锅中浸提2 h，趁热用定性滤纸过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，用30%乙醇清洗滤纸和残渣，合并滤液用30%乙醇定容，作为待测液。取待测液2 mL置于25 mL容量瓶中，用30%乙醇稀释至10 mL；加入5% NaNO2溶液0.7 mL摇匀，立刻加入10% Al(NO3)3溶液0.7 mL摇匀，放置5 min；加入4% NaOH溶液5 mL，用30%乙醇定容，混匀后放置5 min，用紫外分光光度计测定D510 nm值(以芦丁为标准品)。

1.3.4 加标回收方法已知芦丁含量的金荞麦叶、全株、茎、根分别取2份，其中1份分别加入芦丁标准品0.016、 0.032、 0.032、 0.032 mg。2份同时按1.3.3步骤进行检测分析。

1.3.5 结果计算各检测样品均设2份平行样品进行测定，要求2份平行样品测试结果的绝对差值不大于这2个测试值的算术平均值的10%，2份平行样品的算术平均值作为总黄酮含量的最终结果。

样品总黄酮含量(%)=[由标准曲线得试样浓度(mg/mL)×试样体积(mL)×稀释倍数]÷试样重量(mg)×100%

回收率(%)=(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%

2 结果与分析

2.1 黔中金荞麦植株不同部位总黄酮含量由表1可见，利用紫外分光光度计检测的D510 nm值在最佳线性值(0.2～0.7)范围内。黔中金荞麦植株不同部位总黄酮含量叶>全株>茎>根，分别为10.34%、6.82%、4.36%、2.65%。

表1 黔中金荞麦不同部位总黄酮含量

2.2 总黄酮回收率试验通过标准曲线得到回归方程：y=0.127x-0.008 9，R=1.007，且D510 nm值在0.2～0.7 范围内，具有较好的线性关系。对金荞麦的叶、全株、茎、根样品分别添加芦丁标准品进行回收率试验分析，测得的D510 nm值均在最佳线性值(0.2～0.7)范围内，平均回收率为100.19%，说明本次总黄酮含量的检测分析结果较为理想。见表2。

表2 样品总黄酮量含量回收率试验

3 讨论与结论

3.1由于天然植物的化学成分复杂，用分光光度法进行检测会有许多干扰因素，从而影响检测结果，同时在检测过程中乙醇的浓度、试剂加入时间、显色时间等因素均可对D510 nm值产生较大影响，因此在检测分析过程中需按要求进行实验操作。

3.2通过前期系列预检测试验，本试验确定了黔中金荞麦叶、全株、茎、根的取样重在0.3～0.4 g范围内，可以保证样品处理后的D510 nm值在最佳线性值(0.2～0.7)范围内。通过添加芦丁标准品获得平均回收率在100.19%，说明本次总黄酮含量的检测分析结果较为理想。

3.3通过本试验检测分析表明，黔中金荞麦植株不同部位总黄酮含量，叶>全株>茎>根，分别为10.34%、6.82%、4.36%、2.65%。

3.4由于黔中金荞麦叶、全株、茎、根的黄酮含量受生长年限、采收季节不同而有所变化，其变化规律还有待深入分析研究，以确定最佳采收利用时期。