青海藏族先天性心脏病患者SIRT7基因突变分析

刘世明 王如意 路 霖 李愈娴 李 媛 徐效龙 潘 虹 李腾龑 王彬彬 陈秋红*

1.青海省心脑血管病专科医院(西宁，810000)：2.国家卫生健康委科学技术研究所；3.北京协和医学院

中国现有先天性心脏病(CHD)患者200万人[1]，患病率1‰～7‰。《中国心血管病报告2011》[2]指出，患病率与当地海拔和环境因素有关。一项对青海省不同海拔地区的4～18岁儿童CHD患病率调查[3]显示，标准化后，海拔2000米以上(4.79‰)、3000米以上(5.78‰)、4000米以上(8.84‰)存在统计学差异，且相同地区不同民族患病率也有很大不同。推测在高原低氧环境中，遗传因素可能发挥了重要的作用。越来越多的证据表明组蛋白乙酰化水平异常与心脏发育异常相关[4]，但CHD发生的表观遗传学相关研究很少，特别是去乙酰化酶研究多集中在I类和II类，关于III类研究极少。Sir2相关酶类是III类去乙酰化酶，SIRT1-SIRT7是人类Sirtuin家族的7个成员。近年研究发现SIRT家族成员在低氧诱导信号通路[5-7]和心脏组织发育[8-9]的调节中发挥重要作用。SIRT7基因是Sirtuin家族的重要成员，可通过催化活性和非催化活性调控低氧诱导信号通路和心脏发育相关基因的表达，进而在低氧适应[10-11]和心脏发育[9]等方面发挥重要作用；可能参与心脏组织发育的调控。SIRT7突变的心脏中活化的Akt含量大幅增加[12]，Akt信号通路对心肌细胞增殖和细胞周期有重要影响[13]。因此，本研究通过对青海高原地区藏族CHD患者进行SIRT7基因突变筛查和识别潜在致病突变，研究SIRT7基因变异与高原地区藏族先天性心脏病的发生关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集青海地区254例藏族散发CHD患者为病例组，288例藏族非先心病健康个体作为对照组。本研究通过青海省心脑血管病专科医院伦理委员会批准，并且获得了所有个体或其监护人的知情同意。

1.2 Sanger测序

采集研究对象外周血抗凝，应用QIAGEN试剂盒提取DNA，-20℃保存。用Primer 5.0设计了5对特异性引物(表1)，对SIRT7基因的外显子区及周围序列进行PCR扩增，PCR仪型号S1000TM Thermal Cycler。将两组PCR产物送华大基因公司Sanger测序。

表1 SIRT7基因外显子区引物

1.3 在线网站分析

对检测出的变异位点进行在线分析，在NCBI dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、1000Genomes 数据库(http://browser.1000genomes.org/)、ExAC数据库(http://exac.broadinstitute.org/)和gnomAD数据库(http://gnomad-old.broadinstitute.org/)中进行变异位点频率检索，用Mutationtaster在线预测变异蛋白的有害性。用CLC Sequence Viewer 8软件对SIRT7蛋白进行保守性分析。

2 结果

2.1 纳入样本基本特征

病例组254例中，有128例房间隔缺损(ASD)，39例室间隔缺损(VSD)，58例动脉导管未闭(PDA)，2例ASD、VSD联发，5例PDA、VSD联发，2例ASD、PDA联发，20例不常见的复杂先心病。

2.2 突变筛查

通过突变筛查，在一例藏族女性ASD患者中发现了一个新的SIRT7基因错义突变(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)，如图1-A(见插页)。突变使得SIRT7编码链的第181位碱基由C变成G，导致编码的肽链的第61位氨基酸由亮氨酸变成缬氨酸。对照组未发现该错义突变。

2.3 在线网站分析

在NCBI dbSNP、1000Genomes、ExAD和gnomeAD数据库中进行变异位点频率检索，该突变在4个数据库中均没有出现，表明该突变是新突变。用Mutationtaster在线预测变异蛋白的有害性，预测结果为disease-causing。用CLC Sequence Viewer 8软件在多个物种间对SIRT7蛋白进行保守性分析。从图1-B(见插页)可以看出，这一位点具有很强的进化保守性。

3 讨论

Sirtuins是在进化上保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的III类组蛋白去乙酰化酶[14]。SIRT家族成员在低氧诱导信号通路[5-7]和心脏组织发育[8-9]的调节中发挥重要作用。SIRT7基因位于人染色体的17q25，有10个外显子。与Sirtuins的其他家族成员一样具有保守的催化NAD+结合域和独特的N-和C-端区域，分别包含核和核仁定位信号[16]。有数据表明SIRT7的N区和C区都有助于SIRT7的可溶性表达[16]。而蛋白质只有溶于溶剂中才能发挥催化功效。据报道，激活SIRT7的去乙酰化的酶活性既需要N端区域也需要C端区域[17]。SIRT7多肽链上N区的位于α1的第29位亮氨酸Leu、32位缬氨酸Val、36位亮氨酸Leu、35位的异亮氨酸Ile，位于α2的第50位和51位的亮氨酸Leu，位于α3的第57位亮氨酸、58位缬氨酸Val、61位亮氨酸Leu的这些残基形成一个小的富含亮氨酸的疏水核[16]。

本研究发现的突变就是61位的亮氨酸(位于第3个外显子上)变为了缬氨酸，这可能对于疏水核结构和功能有一定影响。在数据库中变异位点频率检索，该突变均未有出现，证明这个位点的罕见性。用Mutationtaster在线预测变异蛋白的有害性为disease causing，这也为研究提供了佐证。该位点在多个物种间具有高度保守性，本研究只在病例组中发现了该突变，而在对照组未发现，我们推测这个变异可能导致了患者发病。

SIRT7在低氧诱导信号通路调节中发挥重要作用。低氧诱导因子(HIF)1和HIF2是异二聚体蛋白由受氧调节的HIF-1α或HIF-2α亚基和组成型表达的HIF-1β亚基组成，介导对低氧的适应性转录应答[19]。其中HIF-1是调节生理病理状态下氧平衡的关键性转录调控因子，在低氧下能激活多种靶基因的转录，如促红细胞生成素(EPO), 血管内皮生长因子(VEGF)，烯醇化酶1(ENO1)等，这些靶基因参与氧气运输、血管生长和糖代谢等重要的生理病理过程[19]。Hubbi等[10]研究发现，SIRT7是低氧信号通路的负调控因子，可以抑制低氧诱导因子HIF的活性，直接与HIF-1α和HIF-2α蛋白质相互作用，抑制HIF-1α和HIF-2α转录活性及蛋白表达。而体内外实验证实，组蛋白去乙酰化酶抑制可以降低HIF-1α和VEGF的表达，说明它们受到组蛋白乙酰化修饰调控[20]。因此我们认为SIRT7的突变(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)可能导致突变的蛋白去乙酰化酶活性受到抑制，进而导致HIF-1α和VEGF表达下降，导致在低氧状态下心脏发病。

SIRT7可能参与在心脏组织发育的调控。SIRT7突变的心脏中，总体Akt 蛋白水平稍微的增加，但是活化的Akt含量却大幅增加[12]，Akt信号通路调控心肌细胞存活和凋亡，介导心肌细胞肥大及Akt的活化不仅可以诱导心肌细胞的肥大，还能增强小鼠心肌收缩力，对心肌细胞增殖和细胞周期有重要影响[13]。Vakhrusheva等[9]研究发现，SIRT7能导致p53去乙酰化，与SIRT7缺陷小鼠p53过乙酰化和心肌细胞凋亡增加的结论一致。因此本研究发现的这个突变也可能通过导致活化的Akt含量增加、p53去乙酰化而使心肌细胞肥大，进而导致疾病发生，但还需进一步功能试验来验证此观点。

综上所述，本研究通过Sanger测序在青海高原的藏族先心病患者中发现一个新的SIRT7错义突变(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)，表明SIRT7可能与中国西部高原地区藏族的先心病发生有关。SIRT7的突变可能导致机体在低氧适应[10-11]和心脏发育等方面发生改变，导致先心病发生。本研究为进一步理解高原地区藏族先心病的发生机制提供基础。