益心泰丸对阿霉素致心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响及作用机制①

孙 涛 郭志华 曾 英

(湖南中医药大学第一附属医院心血管科，长沙 410000)

心力衰竭(heart failure，HF)是由于心脏损伤引起的心排血量减少不能满足机体代谢需要而引起的一系列综合征，临床表现为咳嗽、呼吸困难、倦怠和乏力等，在美国，每年有400亿美元用于治疗HF[1，2]。HF是以心肌细胞坏死导致心脏功能障碍的特异性疾病，其主要特点心肌细胞肥大、坏死及纤维化导致射血动力不足，心脏功能不全、HF等[3]。文献报道称造成HF的主要原因有炎症感染、心肌细胞坏死、心肌能量代谢紊乱等，因此从上述因素寻找治疗HF的手段，成为当前医务工作者不断探寻的课题[4-6]。益心泰丸主要由黄芪、丹参、红花、泽泻、猪苓等中药组成，研究表明益心泰丸具有改善血流动力、抑制心室重构、减缓HF、抑制心肌凋亡、抑制炎症因子等作用，但其作用机制尚未见有报道[7，8]。在细胞凋亡过程中，磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路对相关蛋白的调节发挥关键作用，可将膜受体信号传递至细胞内，来实现维持细胞增殖和抑制细胞凋亡过程。作为Akt的底物，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是调节细胞凋亡的关键元件[9]。本研究采用HDR诱导的HF大鼠为模型，从PI3K/Akt/GSK-3β信号通路探讨益心泰丸对ADR诱导的HF大鼠心功能的保护作用，从而为其临床应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物 清洁级Wistar大鼠由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号: SCXK(湘)2009-0001。

1.1.2主要试剂 阿霉素购自Sigma公司；TUNEL试剂盒购自博士德生物公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、化学发光试剂盒购自广东锐博生物科技技术股份有限公司；兔抗鼠Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β、兔抗GAPDH以及山羊抗兔IgG采购自美国Abcam公司；IL-6、TNF-α检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；PRA、AngⅡ、ALD 试剂盒购自尚柏生物医学技术有限公司。

1.2方法

1.2.1模型构建和分组处理 实验前大鼠适应性饲1周，随机分为4组，每组15只，分别为空白对照组，模型组、益心泰丸组和开博通组，实验前禁食24 h，腹腔注射2.5 mg/kgADR，48 h后二次注射ADR(2.5 mg/kg)构建模型，彩超检测心功能障碍时提示模型构建成功，空白组和模型组给予等体积的生理盐水，益心泰丸组和开博通组分别灌胃给予相应药物5 mg/kg，连续给药4周。

1.2.2大鼠血浆内PRA、AngⅡ、ALD含量变化情况检测 给药4周后空腹尾部采血，采用PRA、AngⅡ、ALD试剂盒检测各指标变化。

1.2.3超声检査心脏结构的变化 给药4周后，麻醉大鼠，固定于手术台，心脏彩超检查心脏功能和心脏结构情况。记录左室收缩期(LVPWs)、舒张期后壁厚度(LVPWd)等数据。

1.2.4HW/BW检测 大鼠处死后，打开胸腔暴露心脏，结扎取心脏，生理盐水洗净血液，吸水纸吸干，称取心脏重量，计算HW/BW。

1.2.5HE染色观察大鼠心肌组织的病理学改变 取新鲜心脏组织，生理盐水洗涤，10%中性甲酸缓冲液固定12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、铜质模具包埋，连续切片4 μm 的组织切片，二甲苯脱蜡、水化 ，经苏木精-伊红染色，65℃ 2 h，生理盐水冲洗，盐酸酒精分化，PBS洗涤，伊红染色，梯度酒精脱水，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.6TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡情况 将大鼠心肌细胞石蜡切片，3%H2O2浸洗3次，PBS洗涤3次，0.01 mol/L TBS缓冲液冲洗，0.01 MTBS，加入蛋白酶K溶液工作液在30℃室温水解15 min，PBS洗涤3次，加入含2%H2O2的PBS反应10 min，PBS洗涤；然后加入TUNNEL反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应60 min，温度37℃，PBS漂洗，加50 μl的 conberter-POD，加封口膜在暗湿盒中反应1 h，温度37℃，PBS漂洗，然后加入DAB 20℃反应15 min，PBS漂洗，苏木素复染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察，凋亡阳性细胞呈棕黄色，在光学显微镜下计数，5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞数量占总细胞数量为细胞凋亡阳性指数AI。

1.2.7ELISA法检测血清TNF-α和IL-6的表达 给药4周后尾部采血，2 000 r/min离心10 min，取上清按照ELISA试剂盒说明书操作检测血清中TNF-α和IL-6水平。

1.2.8Western blot检测Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β 冻存的心肌组织加入RIPA组织裂解液中匀浆器打碎，冰浴5 min后，离心，离心条件：13 000 r/min，4℃，时间10 min，获得上清液，BCA蛋白定量试剂盒进行上清液中蛋白浓度的定量检测，用2倍电泳缓冲液稀释蛋白至相同浓度。10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，用Tris/甘氨酸缓冲液将蛋白转移至PVDF膜上，5%TBST液中室温封闭2 h，将PVDF膜放入相应一抗稀释液(均为1∶1 000)中孵育，4℃过夜。次日，将膜取出，TBST液洗涤10 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(均为1∶10 000)，室温孵育2 h，加入DAB发光液，凝胶成像仪下读取读取灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

1.3统计学分析 数据统计采用SPSS16.0软件，作图工具采用Graphpad5.01，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1益心泰丸对ADR诱导HF大鼠血浆内 PRA、AngⅡ、ALD含量的影响 如图1所示，模型组的PRA、AngⅡ、ALD水平显著高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)。益心泰丸组和开博通组PRA、AngⅡ、ALD显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；益心泰丸组、开博通组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌厚度的影响 模型组的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW显著高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组和开博通组的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组、开博通组，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌厚度的影响Fig.2 Effect of Yixintai Pill on myocardial thickness of ADR-induced HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05.

2.3益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌组织病理学的影响 模型组大鼠心肌呈片状坏死、空泡性变性、心肌纤维增多、心肌细胞片状溶解；空白组大鼠心肌细胞排列整齐、少量成纤维细胞、心肌细胞结构清晰；益心泰丸组和开博通组心肌纤维化、变性等较轻，肌纤维变性、纤维组织增生明显减少，见图3。

图3 益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌组织病理学的影响Fig.3 Effect of Yixintai Pill on myocardial histopathology of ADR-induced HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group.

2.4益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌细胞凋亡的影响 TUNEL染色凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。与空白组相比，模型组AI数值明显升高，益心泰丸组、开博通组与模型组相比AI数值均明显下降更明显，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 TUNEL染色检测益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌心肌细胞凋亡的影响Fig.4 TUNEL staining was used to detect effect of Yixintai Pill on myocardial cell apoptosis induced by ADR in HF ratsNote:A.Blank group；B.Model group；C.Captopril group；D.Yixintai Pill group;compared with model group，*.P<0.05;compared with blank group,#.P<0.05.

2.5益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌细胞TNF-α和IL-6的影响 模型组的TNF-α和IL-6显著高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组和开博通组的TNF-α和IL-6水平显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组、开博通组差异无统计学意义(P>0.05),见图5。

图5 益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌细胞TNF-α和IL-6的影响Fig.5 Effect of Yixintai Pill on TNF-α and IL-6 in myoc-ardial cells of HF rats induced by ADRNote:Compared with blank group，#.P<0.05；compared with model group，*.P<0.05.

2.6益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β的影响 与空白组相比，模型组p-Akt、P-GSK-3β水平明显下降，益心泰丸组和开博通组的p-Akt、P-GSK-3β显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组、开博通组差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

图6 益心泰丸对ADR诱导HF大鼠心肌组织Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的影响Fig.6 Effect of Yixintai Pill on myocardial Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β induced by ADR in HF ratsNote:Compared with model group,*.P<0.05；compared with blank group，#.P<0.05.

3 讨论

益心泰丸具有增强机体免疫、利尿、保肝、降压、扩张冠状动脉、改善心脏功能，调整心律，改善微循环等作用[10]。本研究采用ADR构建HF模型，观察益心泰丸治疗HF的效果，结果显示益心泰丸能够明显降低HF模型大鼠血浆内 PRA、AngⅡ、ALD的含量，证明益心泰丸可抑制RAAS 过度激活保护心肌细胞，改善心脏功能。国内学者杨明等[11]研究表明益心泰丸能能够显著降低HF模型大鼠血浆内PRA、AngⅡ、ALD的含量，与本文研究结果一致。

HF是由于心肌细胞坏死导致心脏功能障碍，严重危害人们身体健康的一种疾病，其特点主要以心脏纤维坏死、心脏射血动力不足、心脏功能不全等症状为主[12]。文献报道称HF最先出现左心室功能损害，随着病情的发展不断恶化影响其他心肌结构与功能，最终引起不可逆的心力衰竭[13]。本研究中的超声结果显示模型组的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd、HW/BW显著高于空白对照组，提示心脏的左心室结构出现了损害，而益心泰丸组的LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明益心泰丸保护ADR大鼠的心脏功能。

HF发病机制尚不明确，文献报道称，心肌细胞凋亡、心室重构在 HF的发生发展中起重要作用，是HF发生重要因素之一，阻断心肌细胞凋亡可以降低HF的发病率，延缓HF的发展速度，改善心脏各项功能[14，15]。本研究HE染色结果显示模型组大鼠心肌呈片状坏死、空泡性变性、心肌纤维增多、心肌细胞片状溶解，提示HF大鼠的心脏细胞结构发生明显改变，而益心泰丸可以使心肌纤维化变性较轻，减少纤维组织增生。既往研究结果显示益心泰丸可以明显抑制心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡[16]。本研究中TUNNEL染色结果显示HF组大鼠心肌细胞凋亡明显，凋亡指数明显高于空白组，口服益心泰丸后，心肌细胞凋亡指数明显下降。

研究表明PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的活化是心室重构的重要信号转导通路之一，该信号通路激活与心肌细胞凋亡密切相关[17]。本研究结果显示与空白组相比，模型组p-Akt、p-GSK-3β水平明显下降，益心泰丸组和开博通组的p-Akt、p-GSK-3β显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，益心泰丸组、开博通组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，从而提示PI3K/Akt/GSK-3β信号通路参与了HF的发生发展，采用益心泰丸处理后，p-Akt、p-GSK-3β水平明显升高，说明益心泰丸可能是通过上调PI3K/Akt/GSK-3β信号通路来保护HF的心脏功能。

综上所述，益心泰丸可能通过上调PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，抑制细胞凋亡，抑制心室重构，从而保护心脏功能。