富血小板纤维蛋白对人牙槽骨骨髓间充质干细胞中Runx2、miR-17 及 BMP2 表达的影响

徐 扬， 赵 文

（榆林市第一医院口腔科，陕西 榆林 719000）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）由于取材方便、成骨分化潜能高、免疫原性低等优点，已成为骨组织再生和修复优良的种子细胞，其可有效解决龋病、牙周病等疾病引起的牙槽骨缺损问题， 从而促进牙疾病的预后[1-2]。 牙槽骨缺损的修复受到骨诱导性生长因子、成骨前体细胞、血供等因素的影响。 BMSCs 作为良好的成骨前体细胞， 其增殖需要多种骨诱导性生长因子的调控， 而富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）自身含有的多种生长因子如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），可有效刺激成骨细胞的增殖和分化，PRF 中的血小板则可分泌纤维蛋白原， 保证BMSCs 迁移并促进组织再生[3]。同时，研究报道显示，雌激素（EST）可调控骨代谢过程中成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化等生物学行为，从而促进骨组织修复，最终达到骨重建的目的[4]。 BMSCs 的生长、增殖、分化受到多种因素的影响， 其中Runt 家族相关转录因子2（Runx2）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein 2,BMP2）是正性调节因子，可诱导成骨细胞分化、细胞基质钙化、骨组织形成等[5]；而miR-17 是一种高度保守的内源性非编码单链小分子RNA， 可抑制Runx2蛋白表达及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性，从而抑制牙周膜干细胞的骨向分化[6]。 目前关于雌激素、PRF 对于BMSCs 及调节性因子的作用差异，文献报道并不多。 因此，本文将通过实验进一步比较，从而为临床治疗方案的选择提供指导。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 试剂 胰蛋白酶（北京索莱宝生物科技有限公司，中国）；DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，中国）；链霉素、青霉素、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma 公司，美国）；CCK-8 试剂购自于日本株式会社；TRIzol 试剂（Invitrogen公司，美国）；人抗兔 CD14、CD29、CD34、CD44 抗体（Biolegend 公司，美国）；羊抗人骨形态发生蛋白2一抗（Santa Cruz 公司，美国）；鼠抗人 β-actin 一抗（Sigma 公司， 美国）； 聚偏二氟乙烯（pdyvinylidene fluoride, PVDF）膜（Invitrogen 公司，美国）；17β-雌二醇（Sigma-Aldrich 公司，美国）。 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）显色试剂盒（碧云天，中国）；TRIzol 试剂盒（北京华迈科生物技术有限责任公司，中国）；TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（Gene Copoeia 公司，美国）等。

1.1.2 仪器 低速离心机（Thermo 公司，美国）；酶联免疫检测仪（Molecular Devices 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本），CO2细胞培养箱（Forma Scientifis 公司， 美国）；PCR 扩增仪 （ABI 公司，美国）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司，美国），4 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱（Haier 公司，中国）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）等。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs 获取 选取 2019 年 2 月—2019 年 4 月于我院口腔科拔牙过程中收集的牙槽骨骨屑（患者年龄20~30 岁，无牙根尖周疾病、无龋坏，所有供者对本次实验知情且同意，且本次实验获得我院伦理委员会批准），于超净台剥离软组织、骨膜后，反复用磷酸缓冲盐溶液洗涤，去除骨组织表面血液等成分，胰酶消化后将细胞去除胰酶，加入PBS，然后将细胞液滴加在等量的Percoll 分离液中，经密度梯度离心获得BMSCs。 并置入含有5 mL PBS、1%青霉素/链霉素的 15 mL 离心管，1 500 r/min 离心 5 min，随后加入DMEM 培养基（含有100 μg/mL 链霉素、100 mg/mL 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺以及15%胎牛血清）重悬细胞，接着转入细胞培养皿中，于5%CO2、37 ℃条件下培养，2~3 d 更换1 次培养基，待细胞达到80%～90%融合时，用0.25 %胰蛋白酶消化、传代，直至细胞传至第3 代时备用。 对第3 代细胞进行细胞表面抗原检测，按照说明书要求加入抗兔CD14、CD29、CD34、CD44 抗体， 并于流式细胞仪上检测。

1.2.2 PRF 制备 血液来源于6 名健康志愿者（充分沟通并签署知情同意书），每名志愿者于清晨空腹抽取 20 mL 外周静脉血，3 000 r/min 离心 15 min。可见管内血液分为3 层， 由上至下依次为血清层、白色凝胶状PRF 层及红细胞层，用无菌镊子夹取中间 PRF 层，备用。 将 PRF 制成 4 mm×6 mm 大小后置入DMEM 培养基中，并于4 ℃下放置7 d，获得PRF 浸出液。

1.2.3 细胞增殖 采用MTT 法检测细胞增殖。将获取的第 3 代 BMSCs 接种于 96 孔板中，100 μL/孔，细胞接种密度为 5×103个/mL。 培养 24 h 后对照组换用 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 完全培养基，PRF 组换用含10% FBS 的PRF浸出液培养，而雌激素（EST）组换用含有10-8mol/L雌激素的10% FBS DMEM 完全培养基。 分别于1、3、5、7、9 d 时每孔加入 10 μL CCK-8 溶液后继续温孵育1 h，随后采用酶标仪测定每孔吸光度值，λ 为 450 nm 处吸光度值，平行 6 份，取其平均值。抑制率（%）=（实验组吸光度值-对照组吸光度值）/对照组吸光度值×100%。

1.2.4 ALP 活性 细胞接种密度为 5×103个/mL，培养24 h 后对照组换用10% FBS 的DMEM 完全培养基，PRF 组换用含10% FBS 的PRF 浸出液培养，而EST 组换用含有10-8mol/L 雌激素的10% FBS DMEM 完全培养基。 分别于 1、3、5、7、9 d 时收集各组细胞培养液，按照ALP 活性比色法定量检测试剂盒说明书操作处理，并于405 nm 波长处测定硝基苯酚的吸光度值，并换算ALP 活性。计量单位为U/μg，ALP 活性=（样品吸光度值-对照组吸光度值）/对照组吸光度值/Cp×100%， 其中样品吸光度值为PRF组、EST 组实测值， 对照组吸光度值对照为对照组实测值，Cp 为样品蛋白浓度。

1.2.5 BMP2 以及Runx2 蛋白表达水平 于第0、7 天抽提蛋白，并用 BCA （Bicin choninic acid）法进行蛋白定量，于-20 ℃ 保存待用。 取样品20 μg 进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophorsis, SDSPAGE，10%）实验，待蛋白电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinglidene fluoride，PDVF）膜上，加入封闭液（5%脱脂牛奶），并于摇床上置室温放置1 h，随后用TBST 漂洗3 次，将膜取出，清洗，进行一抗孵育和二抗孵育，温孵育1 h 后，TBST 洗涤3 次。最后滴加电化学发光（electrochemi luminescence, ECL）进行曝光显影， 调整曝光时间直至出现最佳条带，并检测蛋白质条带，以 β-actin 为内参，用Bandscan软件分析各条带灰度值，检测BMP2 及Runx2 蛋白含量。

1.2.6 Runx2、miR-17 转录水平 细胞培养处理与细胞增殖相同，并于第0、7 天收集细胞，用PBS 洗2 次，使用 TRIzol 试剂盒提取血清总 RNA，以 5 μL血清总RNA 为模板， 按TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒说明书的要求将提取的总RNA 逆转录成cDNA（表 1）。 以 U6 作为内参基因，使用荧光定量PCR 扩增仪检测 Runx2、BMP2 mRNA 及 miR-17 相对表达量（2-ΔCt）[7]，其中 ΔCT=CTmRNA-CTU6。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计分析软件对不同组别各项指标间差异进行评价， 实验结果均以均数±标准差（）表示，同一指标不同时间点的比较应采用重复测量方差分析， 两两比较行LSD-t检验或者SNK-q 检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞表型鉴定

抗原检测结果显示CD29、CD44 高表达， 分别为97.23%、92.23%；CD14、CD34 低表达，分别为 4.15%、0.53%。 同时倒置显微镜下观察显示细胞呈梭形或多边形，见图1。

图 1 原代 BMS Cs 形态（×200）Figure 1 Morphology of primary BMSCs （×200）

2.2 细胞增殖情况

3 组细胞随着培养持续， 细胞数量均逐渐增加，于第7 天达到最高水平，随后增殖逐渐减慢。 其中PRF 组、EST 组细胞于第3 天开始细胞增殖速率显著高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 3 组细胞增殖情况Figure 2 Comparison of cell proliferation in three groups

2.3 碱性磷酸酶活性

3 组细胞随着培养持续， 碱性磷酸酶活性均逐渐增加，并于第7 天达到最高水平，随后碱性磷酸酶活性增长逐渐减慢。 PRF 组、EST 组细胞于第3天开始，碱性磷酸酶活性均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

2.4 BMP-2 以及Runx2 蛋白表达水平

培养 7 d 后，PRF 组、EST 组 BMP-2 以及 Runx2蛋白表达水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 4、5。

2.5 Runx2、miR-17 水平

BMSCs 经处理后， 培养 7 d 的 miR-17 水平显著降低，而Runx2 水平显著增加，其中PRF 组、EST组在7 d 时表达水平显著优于对照组， 差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

图3 3 组细胞碱性磷酸酶活性Figure 3 Alkaline phosphatase activities in three groups

图4 蛋白表达水平Figure 4 Protein expression level in three groups

图5 3 组细胞培养7 d 后Western blot 检测蛋白表达水平Figure 5 Western blot analysis of protein expression level in three groups after 7 days

3 讨论

口腔种植过程中容易出现骨缺损、牙槽骨骨量不足等问题， 牙齿被拔除后可导致牙槽骨吸收，引起牙槽嵴高度降低，从而影响手术效果。 骨组织工程的快速发展为骨组织的再生和修复提供了新的方法。 BMSCs 是常见的干细胞，由于具有多向分化潜能，在适宜条件下可分化为成骨细胞，促进骨组织的修复，同时还能避免免疫排斥、组织配型等问题[7]。 研究发现，雌激素、PRF 均可促进骨组织的修复， 其中雌激素水平与骨组织代谢活动密切关联，可通过降低骨转换、 抑制骨丢失从而提高骨密度，降低骨质疏松性骨折的风险[8]，还能促进成骨细胞增殖、抑制破骨活性等，从而促进骨修复，活化牙周膜干细胞中的 Wnt/β-catenin 信号通路[9]，诱导牙周膜干细胞的成骨分化。而PRF 是全血经过离心后获得的富含血小板、生长因子（TGF-β、PDGF）的血浆，可有效促进细胞的生长、增殖、分化等生物学行为，已被用于人牙槽骨成骨细胞、骨髓间充质干细胞的修复[2-3]。 本文通过将获取的人牙槽骨BMSCs 经过雌激素、PRF 处理后发现， 两组细胞随着培养时间增加，细胞数量均逐渐增加，并于第7 天达到最高水平，且各时间点增殖水平均显著高于对照组，表明雌激素、PRF 均可有效促进BMSCs 的增殖。 同时，通过观察不同时间点ALP 活性后发现， 经雌激素、PRF 处理后，ALP 活性均显著增加， 进一步证实PRF 可有效地促进细胞增殖。 ALP 是BMSCs 成骨分化最早表达的一种基因， 可评价成骨细胞功能，其水平的显著增加可促进细胞外基质磷酸含量增加，从而使得基质钙化，促进成骨细胞生物矿化的过程，故而诱导骨组织的修复[10]。

表 2 3 组 BMSCs 经处理后 Runx2、miR-17 表达水平（>）Table 2 Expression level of Runx2 and miR-17 in BMSCs of three groups after treatment

表 2 3 组 BMSCs 经处理后 Runx2、miR-17 表达水平（>）Table 2 Expression level of Runx2 and miR-17 in BMSCs of three groups after treatment

注：* 表示与 0 d 对比，P<0.05。

Runx-2 mRNA 0 d 0 d 7 d EST 组 1.164±0.113 0.582±0.149* 0.893±0.087 1.863±0.156*PRF 组 1.147±0.126 0.483±0.134* 0.871±0.089 2.064±0.172*对照组 1.117±0.085 0.868±0.136* 0.883±0.077 1.637±0.148*F 2.168 14.130 19.415 10.833 P 0.143 0.000 0.000 0.001组别 miR-17 7 d

破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成是一个动态平衡的过程， 当骨吸收强于骨形成时，则可导致骨质疏松、骨缺损等[11]。 骨缺损修复受到人体多种因子（BMP2、ALP、TGF-β1）和信号通路（BMP/Runx2/Osx 等）的调控[5]，其中 BMP2 是目前已知的成骨活性最强的骨形态发生蛋白，具有较强的骨组织形成诱导能力， 可促使BMSCs 向成骨细胞分化，从而促进细胞基质钙化[12]，加速骨重建。 Runx2 则是骨发育过程中激活、启动BMSCs 向成骨细胞分化及促进成骨细胞成熟的转录因子之一[13]，还能调控多种成骨相关基因的表达，如miR-17、BMP2 等。 本研究显示， 培养 7 d 后，BMP-2、Runx2 蛋白表达水平及Runx2 水平均显著增加，表明PRF 可显著提高BMSCs 分化、 增殖相关因子水平，从而促进细胞增殖、分化，可加速牙槽骨骨组织的修复。 MicroRNA 作为高度保守序列，其在干细胞的自我更新和组织分化的过程中扮演着重要的角色，可通过调控细胞的增殖、分化，从而影响疾病的发生、发展。 本研究发现，经处理后，miR-17 表达显著降低， 表明雌二醇、PRF 均可下调miR-17 的表达， 其中miR-17 表达的下调可一定程度促进Runx2、ALP 等的表达，与邓超等[6]的报道一致，即miR-17 可与特定的靶基因结合而抑制BMSCs 向成骨细胞的分化，进而导致牙槽骨组织、牙周膜无法改建，延缓疾病的预后。 据报道PRF 含有大量的与成骨相关的生长因子（如血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β1 等）以及营养物质，可促进 BMP2、Runx2 的表达，其中 BMP2 可激活Smads 信号传导及调节成骨基因转录。 Runx2 作为BMP2 的靶基因，可直接促进成骨细胞特异性基因的表达（碱性磷酸酶、Osterix 等），进一步促进骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原蛋白等的表达，故而发挥其成骨作用[2,14]。 另一方面PRF 的超微网状结构可将生长因子、血小板通过化学键结合起来[15]，从而保证其稳定的释放，可有效延长生长因子作用时间。 同时，网状结构作为细胞支架，为细胞的增殖分化提供良好的场所，促进新骨形成，有利于骨组织的修复。

综上所述，雌激素、富血小板纤维蛋白均可有效促进人牙槽骨BMSCs 中Runx2、miR-17 及BMP2的表达，从而有利于BMSCs 的增殖、分化。