加热温度对海鲈鱼肌肉品质的影响

吴燕燕，李金星,2，王悦齐，陈胜军，邓建朝

(1 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300；2 广东海洋大学食品学院，广东 湛江524088)

海鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)又名花鲈、七星鲈等，国外主要分布于地中海和大西洋及其近岸水域[1]，国内主要分布于南海、东海和渤海等沿海地区。中国海鲈鱼养殖可以追溯到20世纪60年代，70年代实现批量生产[2]。近年来中国海鲈鱼的养殖业发展迅速，2019年海鲈养殖产量已达18万t[3]。海鲈鱼肉质细腻、味道鲜美、少有鱼骨、富含蛋白质和不饱和脂肪酸等营养物质[4-5]，深受消费者喜爱。热处理是肉制品加工的一种简单且广泛应用的加工方式，通过灭活病原体来提高食物的食用质量和卫生质量，可以改变肉的组织结构、赋予特殊的风味和色泽、确保食品安全的同时延长货架期[6-7]。计红芳等[8]研究加热温度对鹅肉理化性质、质构与微观结构的影响，发现鹅肉较适宜的加热温度为90 ℃～95 ℃。王科瑜等[9]研究了不同中心温度的蒸制过程中大口黑鲈品质的变化，从色差、质构、风味物质和感官评价方面综合考虑，加热温度65 ℃～75 ℃，鱼肉品质突出。海鲈鱼肌肉特性受热加工处理的影响较大，然而不同加热温度对海鲈鱼肌肉特性的影响及其机制的研究却鲜见报道。

以海鲈鱼为研究对象，研究加热温度对海鲈鱼肌肉特性的影响，旨在为海鲈鱼的合理加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

鲜活海鲈鱼，购自当地超市，每尾质量约400～600 g，体长25～35 cm。超微量Ca2+-ATP酶测试盒、总巯基测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白质量浓度测定试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X)及BeyoColorTM彩色预染蛋白，购自上海碧云天生物技术有限公司。

主要试验设备仪器：3K30台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；T50均质机(德国IKA公司)；Powerpac@ Basic基础电泳仪(美国Bio-Rad公司)；GB204电子天平(瑞士METTLLER公司)；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Sunrise-basic Tacan SUNRISE吸光酶标仪(瑞士TECAN公司)；QTS-25质构仪(英国CNS FARNELL公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

快速击晕海鲈鱼，去除鳃、鳞、皮和内脏后用清水冲洗鱼体，沿背脊取出两片鱼肉，将鱼肉切成2 cm×2 cm×1 cm 的样品备用。将数字温度计(精确度为0.1 ℃)的探头插入蒸煮袋中海鲈鱼鱼片的几何中心，立即放入温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃的恒温水浴锅和100 ℃沸水浴锅中隔水加热，直至鱼肉中心温度分别达到40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃。取出鱼块并冷却至室温后，经真空密封袋包装后放置在超低温(-80 ℃)下保存，保存时间不超过5 d。

1.2.2 色泽和质构的测定

取鱼背部、腹部、尾部的鱼肉，去皮，修整为2 cm×2 cm×1 cm的长方块，采用色差仪于室温下测定鱼块正反面的L*值(亮度值)、a*值(红度值)、b*值(黄度值)。每个温度测定3个样品，每个样品测定3次；使用质地多面分析法(TPA) 测试模式；通过二次压缩法测量质构。使用的平底柱形探头直径4 mm，触发点负载5.0 g，设置目标值4.00 mm，测试速度1.00 mm/s。每组试验重复测量10次，去除数据异常值后取平均值。

1.2.3 水分含量和加热失重率的测定

水分含量的测定：按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[10]方法中的直接干燥法测定。

加热失重率测定：加热前，用滤纸擦拭鱼片表面并称重；加热后，冷却至室温，用滤纸吸干鱼片表面并再次称重；依据鱼片样品在烹饪前后的质量变化计算失重率。每个温度测定3个样品，每个样品重复测定3次，取平均值。

1.2.4 肌原纤维蛋白的提取及浓度测定

参考Benjakul等[11]的方法并略有修改，取鱼肉1.0 g，加入10 mL预先冷却(0 ℃～ 4 ℃)的KCl 溶液(0.1 mol /L，pH 7.0)，在冰水浴条件下均质(10 000 r /min)分散2 min，每均质10 s停10 s，以防过热。然后将分散液在4 ℃下以12 000 r /min的速度离心15 min， 去除上清液，所得沉淀加入8倍体积 KCl 溶液(0.6 mol /L，pH 7.0)，再均质匀浆，于4 ℃冰箱内静置1 h，在4 ℃条件下15 000 r /min离心20 min。取上清液，按照上海碧云天生物技术有限公司Bradford蛋白浓度测定试剂盒所提供的方法，借助酶标仪测定肌原纤维蛋白质量浓度。

1.2.5 总巯基含量和 Ca2+-ATP酶活性的测定

使用南京建成生物工程研究所的总巯基测定试剂盒及酶标仪测量肌原纤维蛋白的总巯基含量；参照该所超微量Ca2+-ATP酶测试盒所提供的方法，配合使用酶标仪测定肌动球蛋白Ca2+-ATP酶的活性。

1.2.6 表面疏水性的测定

参照Chelh等[12]的方法并略做修改。取1 mL肌原纤维蛋白溶液，加入0.2 mL溴酚蓝(1 mg/mL)溶液，室温静置10 min，然后以4 000 r/min的速度离心15 min，取上清液稀释2倍，在波长595 nm处测定样品的吸光度值，空白用磷酸盐缓冲液替代蛋白液。表面疏水性用溴酚蓝可结合的暴露出包埋在蛋白质构象内部的疏水性氨基酸残基的量来表示，计算公式：

B=200 ×(A0-A1)/A0

(1)

式中：B—溴酚蓝结合量，μg；200—溴酚蓝溶液中所含溴酚蓝的质量，μg；A1—空白组吸光度；A0—样品组吸光度。

1.2.7 肌原纤维蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法参考Fritz等[13]略做修改。将质量浓度约1.00 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液与上样缓冲液(2X)等体积混匀，煮沸5 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清液作为待测样品。采用5%浓缩胶、12%分离胶，上样量为15 μL。浓缩胶电压80 V，电泳时间约15 min，分离胶电压120 V，电泳时间1.5～2 h，电泳完毕后进行染色2～4 h，摇床脱色4 h，最后用凝胶成像系统扫凝胶图谱并分析条带。

1.2.8 海鲈鱼肉片感官评测

参考魏涯等[14]的方法，对不同中心温度的海鲈鱼片进行感官评定。选择5男5女共10名有感官评分经验的人从气味、色泽、质地、多汁性和嫩度5个方面进行感官评定，每个指标感官评分以10分计，评价标准见表1。

表1 感官评分标准

2 结果与分析

2.1 加热温度对海鲈鱼肉色泽的影响

鱼肉的颜色是评价鱼肉品质的重要指标之一。L*值、a*值、b*值将色泽量化，避免感官评价人为因素的干扰，得到更加清晰可靠的数据。鱼肉颜色(图1)随着鱼块中心温度的升高，L*值、a*值、b*值总体呈现增加的趋势。姜启兴等[15]也得到相似的结论。当中心温度达到60 ℃时，a*值和b*值增大的趋势明显加快，而L*值的增大趋势减慢。这可能是由于中心温度在60 ℃以下时，随着温度的升高，肌球蛋白逐渐变性，所以鱼肉的颜色逐渐变白；但当温度达到 60 ℃后，基本上所有的肌球蛋白已完全变性，温度到 70 ℃以上时主要是肌动蛋白发生变性。由于在鱼肉中肌动蛋白含量比起肌球蛋白含量相对较少，因此，当温度超过 60 ℃以后，色泽的变化就非常缓慢，导致L*值增加的速度由快到慢。另外，加热会降低肌红蛋白的稳定性，70 ℃以上时亚铁肌红蛋白氧化成高铁肌红蛋白导致a*值明显增加。L*值越大，a*值越小，鱼肉颜色越明亮，色泽越佳，结合b*值，当中心温度达到70 ℃时，鱼肉色泽较理想。

2.2 加热温度对海鲈鱼肌肉质构的影响

随着温度的升高，鱼肉的硬度、内聚性和咀嚼性的变化趋势基本一致，鱼肉弹性呈现下降趋势，质构整体发生了显著变化(图2)。

图1 不同加热温度对海鲈鱼肉色差的影响

图2 不同加热温度对海鲈鱼肉质构特性的影响

硬度表现为人体的触觉柔软或坚硬，使食品达到一定变形所需要的力或食品保持形状的内部结合力[16]。硬度在40 ℃～70 ℃迅速上升，70 ℃～90 ℃增大趋于缓慢，可能是因为鱼肉纤维受热收缩，有大量汁液流出，导致鱼肉变硬[17-18]，这与水分含量趋势一致(图4)。90 ℃～100 ℃时鱼肉的硬度略有下降，是因为高温破坏肌纤维的结构，促使肌纤维束变松散，从而导致鱼肉硬度的降低。

咀嚼性作为一项综合的质构评价参数是鱼肉硬度、凝聚力和弹性的集中体现。在70 ℃以下时，随着温度的升高，咀嚼性逐渐增加，可能是肌原纤维蛋白的变性、肌间胶原蛋白的收缩以及肌动球蛋白的脱水收缩综合作用的结果。而在70 ℃以上时其值降低可能是由于胶原蛋白在70 ℃左右开始形成凝胶，咀嚼性下降。由此可见，热加工对海鲈鱼肉的咀嚼性具有双面效应。

内聚性表示鱼肉凝聚程度或保持其完整性的能力[19]。当中心温度从40 ℃升高到70 ℃，内聚性不断提高，鱼肉口感更加细腻[20]，70 ℃达到最佳。但在70 ℃～80 ℃，内聚性呈下降趋势，80 ℃～100 ℃下降趋势减弱，说明一旦中心温度超过 70 ℃，继续加热会使鱼肉的内聚性降低，使鱼肉蛋白变性成为凝胶，肉质变得松散和粗糙。

弹性是变形样品在去除变形力后恢复到变形前条件下的高度或体积比率。随着中心温度的升高，弹性一直呈下降趋势。初期肌球蛋白变性导致弹性下降较快，可能是由于肌球蛋白变性引起的肌肉横向收缩所致[21]。60 ℃以上时肌球蛋白完全变性，肌动蛋白开始变性，因肌动蛋白含量较少致使弹性下降缓慢，此外，结缔组织也会发生收缩，弹性未发生明显变化。弹性在90 ℃～100 ℃时再次下降，是因为高温蒸煮(100 ℃)引起的严重蛋白质变性和肌肉结构收缩所致。

综上，70 ℃处理时鱼肉具有较低的硬度，较高的咀嚼性、内聚性和弹性。

2.3 加热温度对海鲈鱼肉失重率的影响

加热影响了鱼肉的组织结构，从而导致蛋白溶出和水分流失，表现为鱼肉失重率的增加[22-23]。为了保证试验过程鱼肉受热均匀，采用在蒸煮袋内隔水加热的条件下进行，这样鱼肉组织传热速度快且受热均匀。由图3可见，鱼肉失重率随加热温度的升高而增加，当中心温度低于60 ℃时，失重率在10%以下。在温度较低条件下，组织表层蛋白变性较慢，肌原纤维开始受热收缩，但是肌束膜和肌内膜未收缩，所以鱼肉组织内自由水和水溶性蛋白不会大量流失。当中心温度大于60 ℃时，失重率显著增加，中心温度为100 ℃时失重率最高为23.27%。在60 ℃～100 ℃的温度范围内，肌束膜的胶原蛋白变性导致肌束膜强烈收缩、孔隙增大，造成失重率升高的不仅仅是自由水的流失，还包括吸附水和部分结合水以及从肌纤维细胞中溶出的少量肌浆蛋白、脂肪和热溶性胶原蛋白形成的“明胶”溶出物[24]。

图3 不同加热温度对海鲈鱼肉失重率的影响

2.4 加热温度对海鲈鱼肉水分含量的影响

鱼肉加热后的水分含量是表示肌肉持水力的重要指标[25]。海鲈鱼加热过程中温度对水分含量的影响见图4。

图4 不同加热温度对海鲈鱼肉水分含量的影响

水分含量与中心温度呈负相关。当中心温度由40 ℃升高至100 ℃，水分含量由 76.89%降至 73.71%，失水率为3.18%。热处理促使肌肉收缩，也降低了鱼肉蛋白的保水性，从而导致水分含量持续下降[26]。中心温度为80 ℃～90 ℃，失水率的下降趋势较平缓，这可能是因为鱼肉中胶原蛋白在此温度下受热变性转变成可溶于水的明胶，而此时胶原蛋白并未完全溶出，导致明胶吸水，从而弥补了水分的部分流失[27]。

2.5 加热温度对海鲈鱼肉肌原纤维蛋白质量浓度的影响

蛋白质是肌肉组织的主要组成成分，具有重要的结构支撑作用，在各种生理功能方面还充当着重要角色，而蛋白质的降解和变性对鱼肉的风味、口感等产生重要的影响[28]。肌原纤维蛋白占肌肉总蛋白的60%～70%，是鱼肉肌肉组织的主要结构蛋白，与肉制品的加工特性和持水特性密切相关。因此，研究加热过程中肌原纤维蛋白质量浓度的变化是至关重要的。不同质量浓度的蛋白质标准品的吸光度所得到的标准曲线为Y=0.556 9x+0.554 4(R2=0.994 1)，加热温度对于肌原纤维蛋白质量浓度的影响如图5所示。随着中心温度的上升，肌原纤维蛋白质量浓度不断减少，当中心温度从40 ℃上升至100 ℃时，肌原纤维蛋白的质量浓度从1.14 mg/mL降至0.38 mg/mL，仅为40 ℃时的30%左右，可见加热温度对于肌原纤维蛋白质量浓度影响显著。

图5 不同加热温度对海鲈鱼肉肌原纤维蛋白质量浓度的影响

2.6 加热温度对海鲈鱼肉总巯基含量的影响

总巯基包括活性巯基和隐藏的巯基，是鱼肉蛋白中反应活性最强的功能性基团之一，对温度敏感，易发生氧化，或与二硫键交换而引起其含量下降[29-30]。蛋白质结构的稳定性和易变性大都与巯基和二硫键密切相关，因此可以通过测定总巯基含量的变化来反映蛋白质在加热过程中的变性和氧化程度。随着温度升高，总巯基含量下降，下降的原因是加热破坏了肌原纤维蛋白的空间结构，使巯基暴露被氧化成二硫键，导致蛋白的完全变性和聚集(图6)。此外，蛋白质聚合体也会对部分巯基起到掩盖作用。

图6 不同加热温度对海鲈鱼肉总巯基含量的影响

2.7 Ca2+-ATP酶活性的变化

Ca2+-ATPase酶活性是评估蛋白质品质的重要指标，与蛋白质的凝胶特性有关。在水浴加热过程中，温度必然影响酶活性，海鲈鱼的肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase酶活性随着温度的升高不断降低(图7)。

图7 不同加热温度肌原纤维蛋白 Ca2+-ATPase酶活性的变化

Ca2+-ATPase酶活性源于肌球蛋白的球状头部结构，加热使肌原纤维蛋白发生了构象上的变化，肌球蛋白的头部结构也发生改变，蛋白质发生聚集和变性，从而导致酶活性急剧下降[27]。当中心温度在40 ℃～50 ℃时，迅速失活，可能是疏水性氨基酸和巯基相互作用的结果。温度达到60 ℃以上时，酶活力基本保持不变，酶的活性也几乎检测不到。

2.8 加热温度对海鲈鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

疏水键是疏水侧链为了避开水相而聚集在一起的一种相互作用，疏水作用对蛋白质三级结构的稳定性[23]和蛋白质功能特性具有重要意义。可以用溴酚蓝与蛋白质的结合量来表征热处理对肌原纤维蛋白疏水性的影响(图8)。随着温度的升高，溴酚蓝的结合量以60 ℃为分界点先上升后下降，说明肌原纤维表面的疏水性也是如此。但表面疏水性仍比加热初期大，最后趋于稳定。产生这种现象的原因主要是加热使蛋白质侧链展开，致使位于蛋白质内部的疏水性氨基酸暴露在表面，从而增加了肌原纤维蛋白的疏水性[31-32]。而继续加热时肌球蛋白发生聚集，掩盖了一部分疏水基团，减少了疏水性氨基酸残基与水相的接触，因而疏水作用呈现出略有下降的趋势。

图8 不同温度对海鲈鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

2.9 肌原纤维蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

图9可知，不同加热温度下海鲈鱼肌原纤维蛋白的变化，随着中心温度的不断提高，蛋白条带色泽由深到浅甚至消失，说明蛋白质发生解聚或降解。分子质量为130～240 kDa的蛋白质条带明显变浅，说明肌球蛋白重链(MHC)发生变性。肌动蛋白条带深度显著减弱，说明在加热的过程中肌动蛋白逐渐变性，但当中心温度达到100 ℃时还有极少部分的肌动蛋白未发生变性，这与上文分析的肌原纤维蛋白的质量浓度变化趋势一致。当中心温度为70 ℃和80 ℃时，分子质量为50～70 kDa，发生蛋白质聚集现象，形成聚集体[33]。

图9 不同加热温度下海鲈鱼肉肌原纤维蛋白的电泳图

2.10 感官评价分析

由图10感官评分结果可见，加热温度较低时(40 ℃、50 ℃)，鱼肉腥味较重、色泽呈透明状，鱼肉未熟；加热温度在60 ℃时鱼肉只有外层部位熟了，中心部位仍未熟不可食用，鱼肉有腥味也有轻微香味，肉色呈青灰白；随着加热温度的升高，腥味变淡且有鱼肉蛋白的香味，质地变软，色泽为熟化后的白色，肉也鲜嫩多汁，鱼肉的感官评分值增加，当加热温度70 ℃时，鱼肉已熟，多汁性和鲜嫩度最佳；80 ℃的颜色仅次于70 ℃，但是多汁性和嫩度略次于70 ℃；90 ℃～100 ℃是鱼片气味最佳的加热温度范围，但是色泽呈白色偏黄。综合色泽、气味、嫩度、质地和多汁性，海鲈鱼肉加热温度达到70 ℃时鱼肉的品质最佳。

图10 不同加热温度下海鲈鱼片的感官评分

3 结论

研究了不同加热温度对海鲈鱼肌肉品质的影响，表明加热温度对鱼肉品质有较大的影响。随着海鲈鱼肉中心温度的升高，鱼肉的水分含量明显下降，加热失重率大幅上升，导致鱼肉得率下降；加热使鱼肉中肌原纤维蛋白质量浓度、Ca2+-ATPase酶活性和总巯基含量也呈下降趋势，表面疏水性呈先升高再下降的趋势，但总体仍是呈上升趋势，表明鱼肉蛋白逐渐变性；另外，通过对比各中心温度下鱼肉的质地特性、色差值和气味、色泽、质地、多汁性、嫩度5方面的感官评价得分，70 ℃时鱼肉的品质最佳，适合作为海鲈鱼肉的煮制终点温度；该研究也为海鲈鱼的热加工产品开发提供参考。