GATA-3、TSLP和细胞因子在嗜酸粒细胞性慢性鼻窦炎伴有鼻息肉中的表达及意义

段世宏 袁逸铭 刘增平 李勇

兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030

慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉头颈外科的多发病和常见病，发病机制复杂，细胞因子在其发生发展中发挥着重要的作用。GATA-3是特异性表达在Th2（2型T辅助细胞）细胞的转录因子，GATA-3不仅在幼稚CD4+T细胞向Th2细胞分化过程中起关键作用，而且是Th2细胞因子转录所必需的，在呼吸道变应性炎症性疾病的发病过程中具有重要作用［1］。胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是IL-7样细胞因子，可诱导Th2炎症反应和调控GATA-3表达［2］。但GATA-3在嗜酸粒细胞性慢性鼻窦炎伴有鼻息肉（eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，ECRSwNP）的发病机制中研究甚少。本研究应用免疫组织化学和实时荧光定量PCR检测GATA-3和TSLP在ECRSwNP和非嗜酸粒细胞性慢性鼻窦炎伴有鼻息肉（non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，non-ECRSwNP）中表达，并用酶联免疫吸附试验检测IL-4和IL-5的含量，探究GATA-3和TSLP在ECRSwNP发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2018年12月在兰州大学第二医院耳鼻咽喉头颈外科行鼻内镜手术的48例慢性鼻窦炎伴有鼻息肉患者（CRSwNP）和20例行单纯鼻中隔矫正术的患者（对照组）。CRSwNP组48例中，男 28例，女 20例，年龄（24.0±11.2）岁，其中ECRSwNP 25例（ECRSwNP组），non-ECRSwNP 23例（non-ECRSwNP组）。对照组20例中，男11例，女9例，年龄（21.0±8.5）岁。CRSwNP患者的诊断符合CRS的诊断标准（2018）。所有患者无前期鼻部手术病史，术前一个月内未使用糖皮质激素、抗组胺药及抗生素。术中取CRSwNP患者鼻息肉组织和鼻中隔偏曲矫正术患者部分下鼻甲组织，一部分经液氮冷冻后放入-80℃冰箱冻存备RT-PCR或ELISA分析，另一部分经10%多聚甲醛固定6～8h脱水石蜡包埋行免疫组织化学染色。本研究方案获得兰州大学第二医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂。单抗IL-4 ELISA试剂盒（ab215089，abcam），单抗 IL-5 ELISA 试剂盒（ab215536，abcam）；RNA 抽提试剂（Trizol，Invitrogen），逆转录试剂盒（RR036A，TaKaRa），SYBR 实时荧光定量 PCR 试剂盒（RR820A，TaKaRa）；兔抗人 GATA-3单克隆抗体（ab199428，abcam），TSLP 多克隆抗体（ab47943，abcam），免疫组织化学染色试剂盒（SP-9001，中山金桥），DAB显色试剂盒（ZLI-9018，中山金桥）。

1.2.2 苏木精—伊红染色（hemoxylin-eosin，HE）和免疫组织化学染色。对鼻息肉的石蜡切片常规脱蜡水化后，进行HE染色，显微镜高倍视野（×400）下对全部炎性细胞和嗜酸粒细胞计数，每张切片可随机选取5个视野计算嗜酸粒细胞占总的炎性细胞的百分比均值，若＞10%为嗜酸粒细胞性CRSwNP，其余为非嗜酸粒细胞性CRSwNP［3］。GATA-3免疫组织化学染色采用SP法，严格按照试剂盒说明书进行操作，染色后的切片经梯度乙醇溶液脱水，二甲苯溶液透明，中型树胶封片，显微镜观察阳性细胞，阳性细胞的判定标准：GATA-3以细胞质、TSLP主要以细胞质和部分细胞核呈棕黄色颗粒样着色为阳性表达，细胞不着色为阴性表达。

1.2.3 实时荧光定量PCR实验。总RNA提取采用Trizol试剂按操作说明进行，紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度；取1μg总RNA，应用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录，逆转录20μL体系：5×prime script RT master mix 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo DT primer 1μL，Randomer 6 mers1μL，Total RNA 1μg，RNase Free dH2O补足至20μL体系，混匀后37℃逆转录15min，85℃灭火逆转录酶5sec，降至4℃。逆转录的cDNA放于-20℃冰箱保存，用于PCR扩增。

实时荧光定量PCR反应 PCR引物由上海生工公司合成，GATA-3 引物为：forword：5′-CGAGATGGCACGGGACACTA-3′，reverse：5′-TGGTCTGACAGTTCGCACAGG-3′；TSLP 引物为：forword：5′-CGCCTATGAGCAGCCACATT-3′，reverse：5′-TCTTCTTCATTGCCTGAGTAGCATT-3′；内参基因 β-actin 引物为：forword：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，reverse：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′。应用 TaKaRa 试剂盒，25μL 反应体系：SYBRGreen Mix 12.5μL，PCR forword primer 1μL，PCR reverse primer 1μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL。反应条件：95℃预变性 30s，95℃ 5s，60℃30s，40 个循环，最后 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。结果计算：相对定量用 2（-△△Ct）方法。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）。分别取鼻息肉与对照下鼻甲组织各100mg，加入5mL PBS液充分匀浆后，置于1.5mL离心管，3000r/min 4℃离心10min，取上清液，将上清液转入另一离心管，-80℃保存待测。采用IL-4和IL-5单抗ELISA试剂盒检测分离上清液中IL-4、IL-5的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0进行数据统计学分析。率的比较采用 χ2检验；IL-4、IL-5、GATA-3 mRNA和TSLP mRNA的表达量用（±s）表示，进行组间t检验；用Pearson法分析两变量间的相关性，应用Graph-Pad Prism5.0绘制图表，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻息肉的组织学类型及GATA-3的表达 ECRSwNP和Non-ECRSwNP两组病理学见图1a、b，ECRSwNP可见上皮下间质明显的嗜酸粒细胞浸润，Non-ECRSwNP偶见嗜酸粒细胞。ECRSwNP组GATA-3 mRNA表达均高于non-ECRSwNP组和对照组（t值分别为2.678，2.296，P均＜0.01），见图2。免疫组织化学结果证实在ECRSwNP组可见GATA-3阳性细胞，主要位于黏膜下炎症细胞，而non-ECRSwNP组和对照组中见少量阳性细胞或未见阳性细胞，见图 3a、b、c。ECRSwNP 组、non-ECRSwNP组和对照组GATA-3表达阳性率分别为80%（20/25）、17.4%（4/23）、10%（2/20）。组间两两比较，ECRSwNP组GATA-3表达阳性率均高于non-ECRSwNP 组和对照组（χ2值分别为 20.789，18.783，P均＜0.05）。

图1 鼻息肉组织染色（HE染色×400）

图2 三组中GATA-3 mRNA相对表达量

2.2 TSLP表达 ECRSwNP组TSLP mRNA表达高于non-ECRSwNP组和对照组（t值分别为3.224，2.567，P均＜0.01），见图4。免疫组织化学结果证实在ECRSwNP组可见TSLP阳性细胞，主要位于上皮细胞和间质的炎症细胞，而non-ECRSwNP组和对照组中见少量阳性细胞或未见阳性细胞，见图5a、b、c。ECRSwNP组、non-ECRSwNP组和对照组TSLP阳性率分别为86.8%、34.3%和25%。组间两两比较，ECRSwNP组TSLP表达阳性率高于non-ECRSwNP组和对照组（χ2值分别为17.52，19.645，P＜0.05）。

图3 GATA-3免疫组织化学染色（×400）

图4 三组中TSLP mRNA相对表达量

2.3 IL-4和IL-5的含量测定 ECRSwNP组IL-4含量均高于non-ECRSwNP组和对照组（t值分别为2.957，3.295，P均＜0.05），non-ECRSwNP 组和对照组差异无统计学意义（t=0.215，P＞0.05）；ECRSwNP 组 IL-5含量均高于non-ECRSwNP组和对照组（t值分别为4.362，4.775，P均＜0.05），non-ECRSwNP 组和对照组差异无统计学意义（t=0.578，P＞0.05）。见表 1。

2.4 GATA-3、TSLP表达与IL-4和IL-5含量的相关性 ECRSwNP组、non-ECRSwNP组和对照组中IL-4和IL-5含量与GATA-3mRNA表达进行Pearson相关性分析，证实GATA-3与IL-4、IL-5两种细胞因子之间存在显著相关性（r值分别为 0.475，0.502，P均＜0.05）；TSLP与IL-4、IL-5两种细胞因子之间存在显著相关性（r值分别为 0.523，0.462，P均＜0.05）；GATA-3 与TSLP之间存在显著相关性（r值分别为0.742，0.622，P均＜0.05）。

图5 TSLP免疫组织化学染色（×400）

表1 三组IL-4和IL-5的含量（pg/mg，±s）

表1 三组IL-4和IL-5的含量（pg/mg，±s）

组别 n I L-4 I L-5 E C R S w N P 2 5 1 3 1.4±5 8.2 7 5.4±2 5.6 N o n-E C R S w N P 2 3 3 5.3±2 8.2 2 5.2±1 2.1对照组 2 0 3 2.1±2 1.5 2 1.3±1 1.6

3 讨论

CRS临床表现呈现高度异质性，临床上依据是否伴有鼻息肉可分为CRS伴有鼻息肉和不伴鼻息肉。又依据鼻息肉组织中嗜酸粒细胞性浸润程度分为ECRSwNP 和 Non-ECRSwNP［4］。CRS伴有鼻息肉主要免疫病理学特征是诱导较强的Th2免疫反应和嗜酸粒细胞浸润增多［5］。GATA-3在Th2细胞因子转录中起关键作用，是Th1/Th2免疫反应的基本转化因素［6］。GATA-3可促进Th2细胞分化和诱导Th2细胞因子的分泌及抑制Th1细胞因子等机制促进Th2免疫应答。但GATA-3在Th2细胞中转录调控作用依然不清楚，因此明确GATA-3在ECRSwNP发病机制中的作用以及在此基础上进行干预治疗有重要的意义。

CRSwNP是一种嗜酸粒细胞浸润增多的呼吸道炎症性疾病，多种细胞因子存在于鼻息肉组织的微环境中，这些细胞因子可影响嗜酸粒细胞的产生、移行、浸润、活化和死亡等生物学活性。其中Th2细胞因子IL-5在鼻息肉发病过程中具有重要作用，IL-5对嗜酸粒细胞具有广泛作用，参与嗜酸粒细胞的趋化、活化和抗凋亡的过程，是鼻息肉中嗜酸粒细胞发挥效应的关键因子。IL-4是B细胞转化合成IgE所必需的，可直接促进B细胞增殖并合成IgE。而且参与了Th1/Th2细胞间相互调控，研究表明GATA-3对IL-5表达具有调控作用，在Th2细胞分化过程中IL-4可诱导GATA-3表达，且是受时间限制的指令性转化过程［7］。IL-4可通过激活因子6（STAT-6）激活转录因子GATA-3，STAT-6是T细胞上GATA-3表达主要调控因子。将GATA-3导入敲除STAT-6基因的T淋巴细胞可诱导GATA-3表达，且可促进Th2细胞因子的分泌［8］。GATA-3表达可诱导IL-4和IL-5表达增高及干扰素-α表达降低［9］。变应性鼻炎鼻黏膜组织中GATA-3表达增高与IL-4和IL-5上调有关［10］。本研究结果显示在ECRSwNP中GATA-3和IL-4、IL-5表达增高，二者之间表达呈正相关，与Sun等［11］发现相似，说明GATA-3表达与IL-4、IL-5表达存在一致性，提示在ECRSwNP中GATA-3参与了IL-4、IL-5表达的合成。

TSLP主要由上皮细胞，角蛋白细胞，平滑肌细胞和肥大细胞产生，介导天然和适应性Th2反应，TSLP作用于树突状细胞从而诱导CD4+的T细胞产生IL-4、IL-5和IL-13，而在Th2免疫应答中发挥作用。在Ⅱ型固有淋巴细胞（ILC2s）TSLP具有诱导GATA-3表达的能力，TSLP增加细胞表达GATA-3蛋白的频率，并且GATA-3刺激导致GATA-3mRNA表达增加［2］。在Th2细胞TSLP可提高STAT-5的磷酸化和IL-4、IL-5和IL-13产生，STAT-5可直接与GATA-3结合，上调GATA-3表达［12］。GATA-3可能作为IL-4、IL-5和 IL-13的反式激活因子，需要由IL-33和TSLP提供附加信号。本研究结果显示在ECRSwNP中GATA-3和TSLP表达增高，二者之间表达呈正相关，与Mjösberg等［2］发现相似，说明GATA-3表达增高与TSLP密切相关。提示TSLP促进GATA-3表达和IL-4和IL-5产生，GATA-3表达诱导IL-4和IL-5表达增高，从而促进ECRSwNP发生发展。

综上所述，本研究采用免疫组化和实时荧光定量PCR在蛋白和mRNA水平证实GATA-3、TSLP表达在ECRSwNP显著增高，IL-4和IL-5表达也相应增高，并且GATA-3、TSLP表达与IL-4和IL-5含量正相关，GATA-3、TSLP参与了ECRSwNP的发病机制，提示其可能作为治疗ECRSwNP的新靶点。