盐酸利多卡因体外对精子功能及超微结构的影响

2020-12-23 10:55戴研平高晓勤丁贤胜
甘肃医药 2020年9期
关键词:顶体透射电镜超微结构

戴研平 高晓勤 丁贤胜

1.贵州医科大学基础医学院,贵州 贵阳 550004;2.遵义医药高等专科学校基础医学院,贵州 遵义 563000;3.岳阳市岳阳楼区人民医院,湖南 岳阳 414000;4.六盘水市人民医院,贵州 六盘水 553000

盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloric acid,LHA)注射液是一种酰胺类中效局麻药及抗心律失常药,近年来对利多卡因体外作用的报道较多,研究证实该药可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡[1]。目前,具有高分辨率的透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电镜(search engine marketing,SEM)在科学研究中的应用已经日趋广泛,透射电镜具有高分辨率、高放大倍数和高性能的优势[2]。本课题组的前期研究发现,LHA体外作用下,扫描电镜观察到精子头、颈、尾部均出现不同程度的超微结构的改变[3]。本研究通过探讨LHA体外对人精子功能及透射电镜下超微结构的影响,进一步阐明精子功能改变的具体机制,为人类辅助生殖技术的开展及男性不育的诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016~2017年贵州医科大学附属医院生殖医学中心健康青年男性自愿献精者8例,年龄 23~32,平均(26.8±1.8)岁,已正常生育一或两个子女,禁欲3~7天后,手淫取得精液标本,进行精液常规分析,结果都符合世界卫生组织规定的正常标准[4]。研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 20mg/mL盐酸利多卡因(常州康普药业有限公司,10mL/支,国药准字H32022122);1%锇酸(北京化工厂);3%戊二醛(北京化工厂);醋酸铀(上海瑞诚化工有限公司);Epon812环氧树脂(沈阳市强华试剂厂);H-7650透射电镜(日立);计算机辅助精液分析系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司);SPX-150C恒温恒湿箱(天津实验仪器厂)LKBII超薄切片机(湖北泰维医疗科技有限责任公司);HITCH E-1010离子溅射仪(日本日立公司)。

1.3 方法 收集精液标本,待完全液化后随机分为三组,分别为对照组、LHA低浓度组、LHA高浓度组。盐酸利多卡因溶液的配置:取1mL精液不加LHA为对照组,低浓度组、高浓度组分别将0.25mL、0.75mL LHA与适量精液体外共同孵育,使LHA终浓度为5mg/mL、15mg/mL,总体积为1mL。轻轻混匀后,将各组精液标本分别于37℃恒温恒湿箱中孵育1h、2h后取出,用PBS液洗涤3次并离心(2000rpm),每次10min;取1~2滴精液标本,3%戊二醛固定3h;PBS洗15min×3次,1%锇酸固定2h;PBS洗15min×3次;丙酮梯度脱水(30%、50%、70%、90%)各1次×10min,100%3 次×10min;Epon812环氧树脂浸透、包埋、聚合;超薄切片机切片;醋酸铀染色30min;柠檬酸铅染色10min;H-7650透射电镜(日立)观察精子超微结构并摄片。

1.4 观察指标 (1)正常精子头部形态:顶体为双层膜性结构,呈平行贴于核表面,双层顶体膜间为低电子密度,核染色质较均匀;(2)正常精子尾部形态:颈部和尾部结构完整,尾部自然弯曲,其中央纤维鞘呈平行排列,可见微管“9+2”结构;(3)精子顶体完整状况、颈部线粒体鞘肿胀情况。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件,计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LHA对精子功能的影响 LHA对各组精子功能产生影响,随着孵育时间的延长和LHA剂量的增加,改变越明显,主要表现在精子顶体部、颈部异常,精子畸形率和颈部肿胀率呈升高趋势。与对照组相比,低浓度组体外孵育1h、2h后精子结构改变差异有统计学意义(P<0.05);高浓度组体外孵育 1h、2h 后差异均有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

表1 LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果(%,±s)

表1 LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果(%,±s)

注:与对照组相比,*P<0.05

组别 n 时间(h) 顶体畸形率 颈部肿胀率对照组 8 1 8.69±3.56 5.45±4.65 8 2 10.23±3.82 6.36±5.35低浓度组 8 1 23.44±3.8* 9.56±5.39*8 2 25.64±5.63* 15.68±5.68*高浓度组 8 1 48.69±8.36* 41.95±5.49*8 2 55.36±7.69* 52.31±8.69*

2.2 LHA对精子透射电镜检查结果 透射电镜观察低浓度组顶体少部为轻微波浪状,大部为双层膜性结构,呈平行贴于核表面,双层顶体膜间为低电子密度,核染色质较均匀,颈部和尾部结构完整,尾部自然弯曲,其中央纤维鞘呈平行排列,可见微管“9+2”结构。高浓度组顶体与核分离,呈波浪状,胞膜肿胀;颈部肿局部断裂。随着孵育时间的延长,精子超微结构改变越明显,表现在精子顶体部、颈部异常。LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果见图1。

图1 LHA对精子透射电镜的影响(TEM×15000倍)

3 讨论

电子显微镜是目前了解精子形态的最客观最有效工具,其分辨率超高[5]。由于透射电镜的高分辨率,能够观察到精子的胞膜、顶体、胞核、颈体部等结构。精子可分为头、尾两部分,头部有一个高度浓缩的细胞核,核的前2/3有顶体,尾部又分为颈段、中段、主段和末端四部分。顶体是一种特殊的溶酶体,内含多种水解酶,如顶体酶、透明质酸酶等,在受精过程中发挥重要作用。常规精液分析一直是评价男性生育力的诊断标准,精子形态、活动率是受精过程中重的参数之一,与顶体内酶系关系十分密切[6]。本课题组前期研究结果表明,精子顶体内顶体蛋白酶(ACE)、透明质酸酶(HYD)活性的检测可作为一种有效的判断生育力的检测指标[7-10],冷冻及精浆中系列酶与男性不育之间存在密切关系[11-16]。

本研究结果显示,与对照组比较,低剂量组、高剂量组孵育1 h、2h差异均有统计学意义,这与本课题组前期扫描电镜下的结果相似。与对照组比较,实验组精子顶体畸形率和颈部肿胀率较高,且随着LHA终浓度的增高和孵育时间的延长,精子顶体畸形率和颈部肿胀率呈明显上升趋势。

本研究透射电镜观察下,可见胞膜受损,顶体与核分离,核内空泡出现。本课题组前期扫描电镜下观察到随着LHA终浓度的增加和孵育时间的延长,精子头部变扁甚至出现凹陷,本研究进一步证实可能是,其原因可能是:LAH体外作用使精子顶体超微结构改变,胞膜受损,主要表现为顶体内外膜分离,导致顶体内容物丢失或顶体膜上结合的透明质酸酶等活性降低所致。

总之,LHA能够对精子及其超微结构产生影响,且随着LHA终浓度的增加和孵育时间的延长,精子超微结构改变越来越明显,可能是导致人类辅助生殖技术成功率低的原因之一,但LHA能否改变精子基因结构,从而导致精子后续一系列结构及功能变化,有待本课题组后续进一步研究。

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