盐酸利多卡因体外对精子功能及超微结构的影响

戴研平 高晓勤 丁贤胜

1.贵州医科大学基础医学院，贵州 贵阳 550004；2.遵义医药高等专科学校基础医学院，贵州 遵义 563000；3.岳阳市岳阳楼区人民医院，湖南 岳阳 414000；4.六盘水市人民医院，贵州 六盘水 553000

盐酸利多卡因（lidocaine hydrochloric acid，LHA）注射液是一种酰胺类中效局麻药及抗心律失常药，近年来对利多卡因体外作用的报道较多，研究证实该药可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡［1］。目前，具有高分辨率的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电镜（search engine marketing，SEM）在科学研究中的应用已经日趋广泛，透射电镜具有高分辨率、高放大倍数和高性能的优势［2］。本课题组的前期研究发现，LHA体外作用下，扫描电镜观察到精子头、颈、尾部均出现不同程度的超微结构的改变［3］。本研究通过探讨LHA体外对人精子功能及透射电镜下超微结构的影响，进一步阐明精子功能改变的具体机制，为人类辅助生殖技术的开展及男性不育的诊断和治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016～2017年贵州医科大学附属医院生殖医学中心健康青年男性自愿献精者8例，年龄 23～32，平均（26.8±1.8）岁，已正常生育一或两个子女，禁欲3～7天后，手淫取得精液标本，进行精液常规分析，结果都符合世界卫生组织规定的正常标准［4］。研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 20mg/mL盐酸利多卡因（常州康普药业有限公司，10mL/支，国药准字H32022122）；1%锇酸（北京化工厂）；3%戊二醛（北京化工厂）；醋酸铀（上海瑞诚化工有限公司）；Epon812环氧树脂（沈阳市强华试剂厂）；H-7650透射电镜（日立）；计算机辅助精液分析系统（北京伟力新世纪科技发展有限公司）；SPX-150C恒温恒湿箱（天津实验仪器厂）LKBII超薄切片机（湖北泰维医疗科技有限责任公司）；HITCH E-1010离子溅射仪（日本日立公司）。

1.3 方法 收集精液标本，待完全液化后随机分为三组，分别为对照组、LHA低浓度组、LHA高浓度组。盐酸利多卡因溶液的配置：取1mL精液不加LHA为对照组，低浓度组、高浓度组分别将0.25mL、0.75mL LHA与适量精液体外共同孵育，使LHA终浓度为5mg/mL、15mg/mL，总体积为1mL。轻轻混匀后，将各组精液标本分别于37℃恒温恒湿箱中孵育1h、2h后取出，用PBS液洗涤3次并离心（2000rpm），每次10min；取1～2滴精液标本，3%戊二醛固定3h；PBS洗15min×3次，1%锇酸固定2h；PBS洗15min×3次；丙酮梯度脱水（30%、50%、70%、90%）各1次×10min，100%3 次×10min；Epon812环氧树脂浸透、包埋、聚合；超薄切片机切片；醋酸铀染色30min；柠檬酸铅染色10min；H-7650透射电镜（日立）观察精子超微结构并摄片。

1.4 观察指标 （1）正常精子头部形态：顶体为双层膜性结构，呈平行贴于核表面，双层顶体膜间为低电子密度，核染色质较均匀；（2）正常精子尾部形态：颈部和尾部结构完整，尾部自然弯曲，其中央纤维鞘呈平行排列，可见微管“9+2”结构；（3）精子顶体完整状况、颈部线粒体鞘肿胀情况。

1.5 统计学分析 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LHA对精子功能的影响 LHA对各组精子功能产生影响，随着孵育时间的延长和LHA剂量的增加，改变越明显，主要表现在精子顶体部、颈部异常，精子畸形率和颈部肿胀率呈升高趋势。与对照组相比，低浓度组体外孵育1h、2h后精子结构改变差异有统计学意义（P＜0.05）；高浓度组体外孵育 1h、2h 后差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果（%，±s）

表1 LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果（%，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别 n 时间（h） 顶体畸形率 颈部肿胀率对照组 8 1 8.69±3.56 5.45±4.65 8 2 10.23±3.82 6.36±5.35低浓度组 8 1 23.44±3.8* 9.56±5.39*8 2 25.64±5.63* 15.68±5.68*高浓度组 8 1 48.69±8.36* 41.95±5.49*8 2 55.36±7.69* 52.31±8.69*

2.2 LHA对精子透射电镜检查结果 透射电镜观察低浓度组顶体少部为轻微波浪状，大部为双层膜性结构，呈平行贴于核表面，双层顶体膜间为低电子密度，核染色质较均匀，颈部和尾部结构完整，尾部自然弯曲，其中央纤维鞘呈平行排列，可见微管“9+2”结构。高浓度组顶体与核分离，呈波浪状，胞膜肿胀；颈部肿局部断裂。随着孵育时间的延长，精子超微结构改变越明显，表现在精子顶体部、颈部异常。LHA体外与精子孵育后透射电镜检测结果见图1。

图1 LHA对精子透射电镜的影响（TEM×15000倍）

3 讨论

电子显微镜是目前了解精子形态的最客观最有效工具，其分辨率超高［5］。由于透射电镜的高分辨率，能够观察到精子的胞膜、顶体、胞核、颈体部等结构。精子可分为头、尾两部分，头部有一个高度浓缩的细胞核，核的前2/3有顶体，尾部又分为颈段、中段、主段和末端四部分。顶体是一种特殊的溶酶体，内含多种水解酶，如顶体酶、透明质酸酶等，在受精过程中发挥重要作用。常规精液分析一直是评价男性生育力的诊断标准，精子形态、活动率是受精过程中重的参数之一，与顶体内酶系关系十分密切［6］。本课题组前期研究结果表明，精子顶体内顶体蛋白酶（ACE）、透明质酸酶（HYD）活性的检测可作为一种有效的判断生育力的检测指标［7-10］，冷冻及精浆中系列酶与男性不育之间存在密切关系［11-16］。

本研究结果显示，与对照组比较，低剂量组、高剂量组孵育1 h、2h差异均有统计学意义，这与本课题组前期扫描电镜下的结果相似。与对照组比较，实验组精子顶体畸形率和颈部肿胀率较高，且随着LHA终浓度的增高和孵育时间的延长，精子顶体畸形率和颈部肿胀率呈明显上升趋势。

本研究透射电镜观察下，可见胞膜受损，顶体与核分离，核内空泡出现。本课题组前期扫描电镜下观察到随着LHA终浓度的增加和孵育时间的延长，精子头部变扁甚至出现凹陷，本研究进一步证实可能是，其原因可能是：LAH体外作用使精子顶体超微结构改变，胞膜受损，主要表现为顶体内外膜分离，导致顶体内容物丢失或顶体膜上结合的透明质酸酶等活性降低所致。

总之，LHA能够对精子及其超微结构产生影响，且随着LHA终浓度的增加和孵育时间的延长，精子超微结构改变越来越明显，可能是导致人类辅助生殖技术成功率低的原因之一，但LHA能否改变精子基因结构，从而导致精子后续一系列结构及功能变化，有待本课题组后续进一步研究。