低水分活度食品微生物控制技术研究现状

黄晓燕，刘铖珺，李长城, 2，刘丽敏，方婷, 2*

1(福建农林大学 食品科学学院，福建 福州，350002)2(闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建 福州，350002)

低水分活度 (water activity, Aw)食品是指Aw低于0.7的食品或食品配料[1]，主要包括奶粉、花生酱、坚果、调味料、果蔬粉以及通过加入食盐或糖得到的低Aw值产品等。微生物在低Aw环境下一般不能够生长繁殖，例如：大多数细菌、酵母菌和霉菌分别在Aw低于0.9、0.87、0.8时不能生长繁殖，所以在过去，消费者认为低Aw食品不存在微生物安全隐患，但是近几年低Aw食品安全事件发生的越来越频繁。例如：在2016年，美国9个州共有11人因食用被沙门氏菌污染的开心果导致中毒[2];同年，美国有196起因单核细胞增生李斯特菌引起的低Aw食品召回事件[3]。这些报道在一定程度上纠正了人们之前对低Aw食品的错误认识。虽然在低Aw环境下大多数微生物无法生长，但还有少数的致病菌和腐败菌可以在Aw极低的环境中存活数月至数年[4]，当条件适宜时这些微生物就会迅速生长繁殖，给食品安全带来隐患。近年来，低Aw食品微生物安全问题引起各界的广泛关注，因此了解低Aw食品中微生物的致病机理以及低Aw食品微生物控制技术至关重要。本文概述了低Aw环境下易存活的微生物以及低Aw食品微生物控制技术。

1 低Aw环境下易存活的微生物

1.1 革兰氏阴性菌

低Aw食品中的革兰氏阴性菌主要有沙门氏菌、大肠杆菌和阪崎肠杆菌等。沙门氏菌是食品中最常见的致病菌，奶粉、香辛料、花生酱、坚果和蛋制品等都易被该菌污染。沙门氏菌在Aw低于0.83时就无法生长，但可在Aw低于0.6的条件下存活[5]。沙门氏菌在低Aw环境下的存活机制有很多，MATTICK等[6]通过蔗糖、NaCl和甘油调节Aw的方法研究了肠炎沙门氏菌血清型PT4和肠炎沙门氏菌血清型鼠伤寒DT104在Aw不断降低时的存活规律，研究表明，在这种低Aw环境下RPOS基因的表达对这2种血清型沙门氏菌的存活至关重要。还有研究发现低Aw条件下，沙门氏菌会通过累积甜菜碱或调整外膜组成等方式来维持渗透压平衡以提高存活几率[7]。还有研究报道，在低Aw环境下，沙门氏菌会启动群体感应系统形成生物膜，控制基因的表达对自身进行保护[8]。另外，食品组分也会影响沙门氏菌在低Aw环境下的存活率，如HIRAMATSU等[9]研究发现蔗糖、植物自身的脂肪可提高沙门氏菌的存活率，而NaCl、高浓度乙醇(70%)则会降低其存活率。所以，沙门氏菌的耐干燥性与基因表达、菌体的自我调节、食品组分等都有关系。大肠杆菌中大多数菌株对人体无害，但有些菌株会产志贺毒素，通过抑制各种靶细胞蛋白质的合成使人类致病，包括血性腹泻、血液凝结、肾衰竭甚至死亡[10]。在Aw低于0.93时大肠杆菌的生长就会被抑制[11]，但产志贺毒素大肠杆菌可在低Aw环境下存活，如该菌可在Aw低于0.5的面粉[12]中存活2年。还有研究者对小麦粉(Aw<0.5)中产志贺毒素大肠杆菌O121∶H19进行细菌学分析，研究发现面粉在碾磨5～6个月后产志贺毒素大肠杆菌O121∶H19的浓度为0.15～0.43 MPN/100 g，并且在碾磨后10～11个月，细菌浓度没有显著的降低[13]，由此可见产志贺毒素大肠杆菌具有很强的耐干燥性。其致病机理为：以产Veor毒素为主要特征，该毒素也称为类志贺氏毒素，是主要的致病因子[14]。阪崎肠杆菌是一种条件致病菌，多发生在早产儿以及免疫力低下的婴儿，成人发病的报道较少，但该菌引起的婴儿坏死性小肠结肠炎、败血症和脑膜炎等[15]，严重威胁婴幼儿的生命健康。该菌可在Aw为0.2的环境中存活[16]，此外，有研究报道，在婴儿配方奶粉中，阪崎肠杆菌的耐干燥性高于沙门氏菌、大肠杆菌0157∶H7、单核细胞增生李斯特菌[17]，但其存活率主要受Aw和贮藏温度的影响与食品的成分无关，且该菌在Aw为0.25～0.30时存活率更高[18]。其致病机理是病原体易从胃肠道进入血液，大量繁殖后交叉到达中枢神经系统(大脑)的血脑屏障，发病与多重毒力因子有关[19]。婴儿配方奶粉被认为是该菌主要的传播对象[20]。一般情况下，食用革兰氏阴性菌污染的食品后，会引起恶心、呕吐、腹部痉挛、腹泻等症状，免疫力低下的人群更易感染。

1.2 革兰氏阳性菌

低Aw食品中的革兰氏阳性菌主要有蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌、产气荚膜梭菌以及单核细胞增生李斯特菌等。蜡样芽孢杆菌生长Aw范围为0.912～0.95[21]，但该菌可在Aw为0.27～0.78，贮藏温度为45 ℃的婴儿米粉中存活36周[22]。蜡样芽孢杆菌产生的芽孢是引起人类食源性疾病爆发的一个重要因子，芽孢生命力顽强且高度耐热，能够在极端环境下(低Aw、低温环境等)存活。有研究报道在大米、香料、鱼饲料、婴儿配方奶粉中都有分离出蜡样芽孢杆菌[23]。还有研究者发现土豆泥粉也经常被蜡样芽孢杆菌孢子污染[24]。金黄色葡萄球菌在显微镜下表现为葡萄簇状，产生金黄色的菌落。该菌生长的最低Aw为0.83～0.85，但该菌可以在蛋糕混合物(Aw=0.32)、脱脂奶粉(Aw=0.22)、洋葱汤混合物(Aw=0.14)、明胶甜点(Aw=0.42)中存活[25-26]。此外，SOSPEDRA等[27]报道干草药也会被金黄色葡萄球菌污染。其致病机理是金黄色葡萄球菌产生一系列致病因子，如黏附蛋白、肠毒素、超抗原、中毒性休克综合症毒素、去角质毒素、成孔溶血素、ADP核糖化毒素，蛋白酶等[28]。肉毒杆菌由4种不同的细菌组成，其神经毒素有A到G 7种抗原[29]，但只有A、B、E、F会引起人类中毒[30]。肉毒杆菌在Aw低于0.94时无法生长[11]，但可在低Aw食品中存活，例如：伊朗在一次对传统食品中肉毒杆菌毒素检测中，发现131份传统食品样品中，3.51%的奶酪、6.36%的咸鱼样品检测出肉毒杆菌毒素，主要病原菌是A和E型[31]。产气荚膜梭菌在Aw低于0.94时无法生长，但可在低Aw环境下存活[11]。例如：2007年，欧盟的草药和香料被产气荚膜菌污染导致19例食品安全事件爆发，产气荚膜梭菌的孢子在奶粉中也被检测出[32]，此外，印度南部家禽疾病中心收到298份家禽饲料样本中，有101份分离出产气荚膜梭菌，总体家禽饲料成分的阳性率为33.89%[33]。其致病机理是产气荚膜菌毒素具有卵磷脂酶活性，通过水解构成生物膜的磷脂导致人体致病[34]。此外，该菌产生的肠毒素也是引起人类食物中毒的主要因子，这种肠毒素影响上皮细胞，尤其是绒毛顶端的上皮细胞，导致人体液体流失和腹泻[35]。单核细胞增生李斯特菌在Aw低于0.85时就无法生长[36]。但有研究报道，婴儿配方奶粉(Aw=0.28)在35 ℃储存4个月后仍可检测出该菌[37]。其致病机理是细菌可以穿过肠屏障，从肠系膜淋巴结扩散到脾脏和肝脏，从脾脏和肝脏再扩散到大脑或胎盘，从而导致人体致病和孕妇流产[38]。由上述可知，大多数低Aw食品也会被革兰氏阳性菌污染，这些致病菌会对人类的健康造成很大的影响，特别是一些神经毒素，严重时很可能会致命。

1.3 霉菌

除了致病菌外，一些霉菌也能在低水分环境下存活，导致一些低Aw食品受到污染。易被霉菌污染的低Aw食品主要有香辛料、茶叶以及腌肉制品等。霉菌生长的最低Aw为0.6[39]，但该菌可在Aw低于0.6的干香料中存活。2001年，墨西哥对市场上5种不同香料的304个样品进行微生物质量检测，发现有多个样品中存在霉菌[40]。2004年，CHUKEATIROTE等[41]在泰国各种商业茶叶中发现了霉菌的存在。黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的真菌毒素，会导致人体免疫抑制、产生生殖毒性、神经毒性等[42]，不仅影响食品品质还会导致人体致病。

每一种微生物在一种环境下生存久了都会产生抗性或者通过基因突变、物种进化来适应环境变化，所以微生物在低Aw环境下的存活机制与菌体对环境抵抗力的增强、基因突变导致的物种进化以及食品组分等都有很大关系。低Aw食品中的致病菌和腐败菌大多不易被灭活且会产生相应的毒素严重威胁人类的生命健康，我们应引以重视。对于不同的低Aw食品我们应选择合适的微生物控制技术以及贮藏环境来降低微生物的存活率。此外，低Aw食品中的微生物一部分来源于原料，所以应重视原料收获期间或者田间微生物的控制，对于一些可加热的低Aw食品，食用前应充分加热。

2 低Aw食品微生物控制技术

因为低Aw食品在杀菌过程中传热差，且低Aw食品中微生物的耐热性比中、高Aw食品强[4]，所以采用一般的热杀菌无法将其杀灭。目前，低Aw食品的微生物控制方法主要有过热蒸汽灭菌、环氧乙烷熏蒸、辐照处理、红外辐射技术、射频处理、微波处理等。

2.1 过热蒸汽灭菌

过热蒸汽灭菌属于湿热杀菌，其杀菌原理为：在高温状态下，蛋白质发生不可逆变性，导致微生物失活。有学者研究了温度为190～250 ℃、气流速度20～30 m/s的过热蒸汽对大豆粉的杀菌效果，发现过热蒸汽处理时间在10 s以下的杀菌效果相当于蒸煮40～60 min的杀菌效果[43]。葛鹏等[44]研究发现过热蒸汽对玉米粉、辣椒粉等10种粉粒状食品中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和霉菌具有较好的杀菌效果，前3种致病菌在95 ℃、0.15 MPa，5 min时杀菌效果最佳，而霉菌在170 ℃、0.15 MPa，3 min时杀菌效果最佳。李婷等[45]研究发现经过热蒸汽处理的红枣干果，其表面菌落总数远低于国家标准，且在150 ℃，10 s效果最佳。过热蒸汽具有加热速度快、杀菌环境处于无氧状态，对食品的形状无要求等优点，但低Aw食品经过热蒸汽灭菌后水分含量会增加，所以需要进行再干燥，这使得该技术在低Aw食品中的应用受到一定限制。

2.2 环氧乙烷熏蒸技术

环氧乙烷熏蒸具有活性强、渗透力强及扩散力强等优点，可破坏包括孢子在内的各种微生物，其杀菌原理是与微生物的蛋白质发生烷基化反应，使得蛋白质分子的羧基、氨基、巯基和羟基中游离的氢原子相结合生成羟乙基等化合物，从而阻碍有机体的代谢而死亡，这是一种不可逆的杀菌方法[46]。美国每年有40%～85%的香料都是用环氧乙烷熏蒸进行杀菌，因为这种处理方法不会明显地改变香料的外观或气味，但环氧乙烷熏蒸产生的乙二醇和氯乙醇被认为是致癌物质，所以美国对香料中的环氧乙烷和氯乙醇残留量有严格的限制，质量分数分别为7×10-6和940×10-6[47]。目前对于环氧乙烷熏蒸杀菌技术在食品中的使用还存在很大的争议，美国、中国等一些国家允许使用该杀菌技术，但该杀菌技术在欧盟国家受到禁止。

2.3 辐照处理技术

辐照是一种冷杀菌技术。其杀菌原理是微生物的DNA、RNA以及细胞膜在光子或电子的直接作用以及产生的活性氧和游离离子的间接作用下会造成损伤[48]，虽然每种微生物都有一定的DNA修复能力，但当这种损伤程度超过了修复能力时，就会导致生物体的失活或死亡[49]。有学者研究发现经Co60-γ射线处理的大豆蛋白粉，霉菌、大肠杆菌、菌落总数降低效果明显，在8 kGy时杀菌效果最佳，达到100%[50]。因为此研究以穿透能力较强的Co60-γ射线作为辐射源，且食品为粉末状，所以能达到很好的杀菌效果。LEE等[51]以Co60-γ射线作为辐射源，研究其对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的杀菌效果，研究结果表示5 kGy的剂量可降低奶粉中的阪崎肠杆菌，有效D10值为0.76 kGy。但辐照对于低Aw食品的杀菌主要应用于香辛料，在已经批准食品辐照的57个国家中，只有日本和乌拉圭没有批准香料辐照灭菌[49]。我国每年的香辛料总量经辐照杀菌的不少于7万t[52]，美国每年接受辐照处理的食品约有10.3万t，其中干草药和香料约有8万t，占78%[53]。辐照杀菌具有营养成分损失少、易操作、无污染、残留少、节省能源等优点，但大多数消费者仍然无法接受辐照食品，想要消除这种消费心理还需要一定的时间以及更科学验证。

2.4 红外辐射技术

红外辐射是以电磁波形式传递能量，该技术是通过损伤微生物细胞中的DNA、RNA、核糖体、细胞膜和蛋白质，从而达到杀菌的目的[54]。目前，利用该技术杀菌的有香辛料、谷物、粉末状等低Aw食品。PAN等[55]研究发现,远红外技术可有效降低杏仁中的足球菌，90 ℃，10～15 min可使足球菌种群降低5 lg以上，且杏仁品质基本保持不变。ERDOGDU等[56]研究了远红外和紫外对孜然种子的联合杀菌效果，发现在温度为300、250和200 ℃下，分别经过1.57、2.8和4.8 min的远红外处理，然后再紫外处理2 h，孜然种子的总嗜温需氧菌降低到104 CFU/g，达到目标水平。还有研究显示，远红外辐射能够在相当短的时间内有效地减少黑胡椒种子中的微生物，该技术被认为是黑胡椒种子表面巴氏杀菌的替代技术[57]。但是红外线穿透能力较弱，无法对物料的表面和内部起到同时杀菌的作用，所以该技术比较适用于食品表面杀菌，如香辛料。从大多数研究中可知，该技术与其他杀菌技术联合使用可以达到更好的杀菌效果，所以可以开发一些互补型的联合杀菌设备，例如：过热蒸汽与红外辐照联合杀菌设备，既能达到杀菌效果又能解决经过热蒸汽灭菌后食品的再干燥问题。

2.5 射频杀菌技术

射频是一种热杀菌技术，与传统热杀菌技术相比具有热量传递更均匀的优势[58]，与微波杀菌相比其穿透能力更强，杀菌效果更好[59]。所以射频杀菌技术在低Aw食品中的应用已成为研究热点。有学者将接种大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌血清型鼠伤寒的红辣椒粉(12.6%、15.2%、19.1%和23.3%干基)和黑胡椒粉(10.1%、17.2%、23.7%和30.5%干基)在频率为27.12 MHz、电场强度为0.3 kV/cm的射频加热系统中进行处理，将接种后的25 g红辣椒、黑胡椒粉末放在直径6.4 cm，高10.8 cm的聚丙烯罐中，放在底部电极的中心，射频加热至90 ℃。结果表明,在含水量为12.6%(db)的条件下，80 s可使红辣椒中大肠杆菌O157∶H7和鼠伤寒沙门氏菌降至不可检测水平，而在19.1%(db)时仅需35 s。黑胡椒在10.1%(db)和17.2%(db)时，2种病原菌降低到检测限值(110 g/CFU)以下所需的时间分别是60和40 s[60]。赵义存等[61]研究了射频(27.12 MHz)处理对八角粉的杀菌作用，结果表明，射频处理八角粉7 min，在最大限度保证样品质量的条件下可使样品中的微生物降低1.741 CFU/g。虽然射频具有较强的穿透性，但在杀菌过程中也存在一定受热不均的现象，研究者通过翻转物料来解决这个问题。

2.6 微波杀菌技术

微波杀菌有热效应和非热效应两种机理，热效应是指微生物通过吸收微波能量引起温度升高，导致微生物死亡，非热效应是指微生物体内并不会有明显的升温现象，而是生物体吸收微波能后其基因的排列组合状态和机体的运动规律发生改变，从而使微生物的生理活性物质发生变化，导致微生物失活[62]。微波杀菌技术广泛应用在低Aw食品中，例如：SONG 等[63]研究了微波(915 MHz)对花生酱中沙门氏菌的杀菌效果，结果为固定微波频率为915 MHz，功率分别为2、4和6 kW处理5 min可减少花生酱中沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和田纳西沙门氏菌的血清病毒含量0.15～0.42、1.14～1.48和3.24～4.26 lg CFU/g。KINDLE等[64]研究了频率2 450 MHz、功率600 W微波加热对5种奶粉中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌、阪崎克罗诺巴菌和分枝杆菌的杀灭效果，其研究结果表明奶粉中的微生物至少减少为原来的1/5 000。王瑞等[65]研究了微波对麦苗粉的杀菌效果，发现当物料为12 g，微波功率510 W，时间120 s，麦苗粉菌落总数约可降低至原来的90%，大肠杆菌MPN值<30，且产品质量较好。虽然微波杀菌能够较好的保持食品营养成分、改善质构、节省能耗等优点，但微波加热不均的现象仍然存在，为了保证杀菌效果，对于不同的低Aw食品因根据其微生物等特点来选择合适的杀菌技术。

3 展望

低Aw食品的杀菌问题一直是国内外研究的热点，因其微生物的耐热性比中、高Aw食品强，所以，传统的热杀菌方式很难将其杀灭。目前，射频杀菌技术是研究的热点，但有时单独使用射频技术无法使食品中的微生物降到目标水平，可以开发联合杀菌技术来解决这个问题，使其充分发挥各自优点，弥补缺点，达到更好的杀菌效果。例如，射频-过热蒸汽等。对于射频加热不均匀的问题可将放置物料的流化床设计为360°旋转的模式来解决。此外，对于低Aw食品，要在不破坏食品成分的前提下达到完全灭菌，几乎是不可能的，因此，防止污染显得至关重要，食品企业应重视食品加工环境中的卫生清洁、设备杀菌消毒、工作人员操作规范等问题。