鱼头汤在体外仿生消化系统中的运动参数优化及消化特性研究

林柳，陶宁萍,2*

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306) 2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)

金枪鱼是生活在绿色无污染的热带-亚热带海洋深处的大洋性鱼类，肉质细嫩，营养物质丰富且味道鲜美，被誉为“海洋黄金”[1]。头部是金枪鱼加工过程中主要的副产物之一[2]，不仅富含蛋白质、脂质和矿物质元素，且氨基酸种类齐全。鱼头中脂肪含量普遍高于鱼身，且含有钠、钙等丰富的矿质元素[3]。眼窝中还含有大量的多不饱和脂肪酸，特别是二十二碳六烯酸含量高达30%～40%[4]。若将大眼金枪鱼头制作成金枪鱼头汤，则可以有效减少资源的浪费且丰富汤品种类。

微/纳米颗粒(micro/nano-sized particles,MNPs)是食物中营养物质的重要存在形式，通常存在于新鲜牛奶、中草药和加工后的果汁中[5]。已有研究表明河蚬汤[6]、骨汤[7]、金枪鱼头汤[8-9]、三文鱼和鳙鱼头汤[10]中均存在由营养物质间通过组分相互自组装形成的尺寸分布范围从微米级到纳米级不等的颗粒。KE等[11]研究表明，从骨汤中分离得到的MNPs具有一定的药用价值。

体内或体外实验是了解食品、药品或者新功能产品消化行为及特性的重要方法。体外实验由于其成本低、不可控因素少、试验周期短、可重复性高且不受伦理道德限制等特点而被广泛接纳。现已有研究报道了从单一静态反应器到多腔室的动态消化系统[12-14]，但如何更贴近真实地反应体内的消化行为仍是一个巨大的挑战。体外仿生消化系统[15]是在遵循人体解刨学原理的前提下，制作出与人体胃肠道相似的仿生硅胶模型，由进料口、食管、胃、十二指肠和小肠等主要部件构成，通过电机和空压机同时工作，使胃肠道消化过程连续性发生。

本研究借助鱼汤熬煮过程中天然形成的鱼油MNPs，通过优化体外仿生消化系统的运动参数，对MNPs的消化特性进行分析，为人工鱼油制剂和配方提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大眼金枪鱼头[30个,质量(1.52±0.19) kg,长(27.09±2.04) cm,宽(25.69±1.00) cm]，大连翔祥食品有限公司；大豆油，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；KCl、KH2PO4、NaCl、MgCl2·6H2O、(NH4)2CO3、Na2CO3、浓盐酸、CaCl2·2H2O,均为AR级，国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白酶(V900497)、胰酶(P7545)，美国Sigma-Aldrich公司；猪胆盐，上海麦克林生化科技有限公司；载玻片(4951PLUS-001E)，美国Thermo Fisher公司；盖玻片(10212020C)，江苏世泰实验器材有限公司。

1.2 仪器设备

体外仿生消化系统(DHSI-Ⅳ)，晓东宜健(苏州)仪器有限公司；恒温水浴锅(HWS-24)，上海恒科学仪器有限公司；精密pH计SC-412，梅特勒-托利多仪器有限公司；数码相机(550D)，佳能(中国) 有限公司；倒置生物显微镜(MS600F)，上海名兹精密仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼头汤的熬煮

参考QIAN等[8]方法并略作修改。冷冻的鱼头用流水解冻后切成3 cm×3 cm×2 cm的小块，清洗干净后晾干。大豆油(20±1)g在120 ℃预热30 s后加入鱼头(400±2) g油煎40 s。随后在油煎后的鱼头中加入3.2 kg饮用水,在97 ℃下熬煮30 min后，再于90 ℃下熬煮120 min。将熬煮150 min后的鱼头汤分装于150 mL的小瓶中待用。

1.3.2 消化液模拟液的配制

胃液模拟液(simulated gastric fluid,SGF)和肠液模拟液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制参考MINEKUS等[16]的方法，具体见表1。

表1 模拟消化液的制备Table 1 Preparation of simulated digestion fluids

以配制100 mL的SGF为例，称取600 mg胃蛋白酶溶解于75 mL SGF浓缩液中(使得胃蛋白酶的最终酶活力为4 000 U/mL)，再加入0.05 mL 0.3 mol/L的CaCl2溶液和24.95 mL去离子水，用6 mol/L HCl溶液调节pH至2.0。同样SIF的配制也以100 mL为例，称取0.4 g胰酶和0.85 g胆盐溶剂于75 mL的SIF浓缩液中(使得胰酶的最终酶活力为200 U/mL、胆盐的最终浓度为20 mmol/L)，加入0.2 mL 0.3 mol/L的CaCl2溶液和24.8 mL去离子水，用6 mol/L HCl溶液调节pH至7.0。

1.3.3 胃排空运动参数的确定

食物从胃排到十二指肠的过程称为胃排空，一般发生在食物进入胃的5 min后。食物在体内的胃排空情况受其物理状态和化学组成的影响，已有文献表明[17-18]，排空300 mL的纯水需要1 h，混合果汁和牛肉食用时，排空时间需要2 h。因此，本实验基于已有的体内文献数据且为更好的重现鱼汤在胃内的消化状态，将胃内的消化时间确定为2 h。

1.3.3.1 模拟胃消化和排空

通过改变设备的运动参数，制作胃排空曲线与体内数据进行对比，最终重现近似于体内的胃排空曲线。胃倾斜角的变化和幽门打开频率是影响胃排空曲线的重要因素，在大量前期预实验结果的基础上，本实验设置了2组微调实验，即不同的胃倾斜角和不同幽门打开频率对胃排空曲线的影响，以300 mL鱼汤和150 mL模拟胃液消化液为例，具体参数见表2和表3。

表2 不同胃倾斜角对胃排空曲线的影响Table 2 Effects of different gastric tilt angles on gastric emptying curve

表3 不同幽门打开频率对胃排空曲线的影响Table 3 Effects of different opening frequency of pylorus on gastric emptying curve

1.3.3.2 胃内剩余百分比的计算

每30 min取1次样，计算排出的液体占总量的比值，得出胃内剩余的百分比，重复3次实验。按公式(1)计算

(1)

式中：ω，胃内剩余百分比，%；m1，胃内排出的液体质量，g；m2，进入胃内食物的质量，g；V，空腹胃液体积，mL；v，胃液流速，mL/min；t，取样的时间，min；ρ，注入的胃液的密度，g/mL。

1.3.4 模拟胃肠道消化

在消化开始时，提前20 min 打开体外仿生消化系统的控温系统，即环境加热和水浴加热，使实验开始时系统温度为37 ℃，同时将300 mL鱼汤、150 mL SGF和450 mL SIF在水浴锅37 ℃中预热。按表4设置设备运行参数。实验前设置蠕动泵工作，使得消化液充满分泌管。实验过程中每30 min取1次样，并置于4 ℃以抑制酶活性备用。

表4 设备运行参数Table 4 Equipment operating parameters

1.3.4.1 pH变化

每10 min取1次样，取样后，立即用pH计测定，并记录。

1.3.4.2 金枪鱼头汤中MNPs形貌特征的观察

每30 min收集1次样，用于显微镜观察。取15 μL消化物于载玻片上，小心盖上盖玻片，用倒置生物显微镜(×50目镜)观察金枪鱼头汤在胃肠道消化过程中MNPs的形态变化。

1.3.5 数据分析

利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2018对数据进行分析和生成图像。

2 结果与讨论

2.1 胃倾斜角和幽门打开频率对胃排空曲线的影响

胃排空行为在整个人体消化系统中占据着重要地位，其不仅影响着食物的消化吸收，也与许多疾病的发生密切相关，因此在模拟体外消化的过程中是不可忽视的，有必要通过运动参数的调节使其接近体内真实情况，从而保证实验的真实可靠性。不同胃倾斜角和幽门打开频率对胃排空曲线的影响，如图1所示。

a-胃倾斜角；b-幽门打开频率图1 不同胃倾斜角和不同幽门打开频率对胃排空曲线的影响Fig.1 Effects of different gastric tilt angles and opening frequency of pylorus on gastric emptying curve

图1-a呈现的是在保持胃挤压次数不变，即胃挤压3次，幽门打开1次的情况下，通过改变胃倾斜角度，得到的不同的胃排空曲线。由图1-a可知，在消化过程中没有出现明显的胃排空滞留现象，且3条曲线的变化趋势大致一致，呈现一种近似于指数型的排空，这与体内实验的排空曲线类似[17]。在前30 min，3组数据的胃倾斜角度一致，因而这段曲线完全重合。在30～60 min，胃排空曲线出现差异性，A曲线在B和C的上方，表明在参数A的条件下，鱼汤的排空速率最低，同样可以推断出，曲线C的排空速率最快。在60 min的时间点上出现明显的差异是由于在这30 min内，参数C整体比A多移动了6°，比B多移动了3°，同时说明了胃倾斜角与胃排空速率直接相关。在90 min的时间点上，曲线B、C的数据点时间相互靠近，是由于在30～90 min，2组参数的总倾斜角度是一样的。在90～120 min，曲线A的下降速率大于B和C，且在排空终点曲线B、C的数据点几乎重合，这与整个排空过程中的总倾斜角度有关。在胃排空终点，参数B和C胃内残余液体约为6.2%，与体内约为5.0%[18]更为接近，且曲线C的变化更为平缓，与体内的排空曲线更接近，因此优选参数C进行下一步优化。

在参数C的基础上保持胃倾斜角不变，改变幽门的打开频率，结果如图1-b所示。胃排空曲线受幽门频率的影响不大，都在可接受的范围之内。这可能与样品的物理性质有关，鱼汤属于液体食物，排空速度较快，几乎可以忽略粒径、黏度等因素的影响。综合以上结果与体内排空果汁的数据[18]，最终确定胃倾斜角和幽门打开频率的运动参数为：倾斜角在0～1 min为0°/min，1～4 min为3°/min，4～31 min为-0.1°/min，31～61 min为-1.0°/min，61～91 min为-0.4°/min，91～121 min为-0.1°/min；幽门在0～6 min胃挤压次数为30次，6～121 min胃挤压次数为3次。

2.2 金枪鱼头汤在体外防生消化系统中的胃消化

2.2.1 胃内的pH变化

在体外模型中创建与实际人胃中相似的pH变化曲线对于有效模拟消化过程至关重要。因为不同食物自身物理性质和缓冲能力的差异性，使其在胃内的pH的呈现出不同的变化趋势，食物在经口摄入再进入胃时，pH值会出现不同程度的滞后期[19]。人体进食后，胃液分泌，pH急剧降低，随着胃排空的进行，胃内pH逐渐达到空腹胃液的状态[20]。经过多次实验，最终得到了贴近体内pH数据的设备运行参数，即在设备运行1 min内以15 mL/min的速度流加30 mL胃液，即空腹胃液；用备用泵在1～21 min以0.3 mL/min的速度流加1 mol/L的HCl溶液用于调节胃内pH。

图2显示了在体外防生消化系统中金枪鱼头汤在模拟胃消化过程中pH的变化。可以看出，鱼汤在模拟胃的消化过程中，pH值从6.8(0 min)逐渐下降到1.8(30 min)，这与SULLIVAN等[21]的研究变化趋势一致，与静态实验pH值存在差异，静态实验忽略了人体真实的pH变化，简单将pH定为2或者1.5，这与体内数据不符。在30～120 min时，胃内pH维持在1.5左右。课题组前期研究结果表明[13]，金枪鱼头汤中的MNPs是由甘油三酯为核心，蛋白质、磷脂和糖基化分子在外围的球形颗粒。胃消化过程中胃蛋白酶将大分子蛋白质降解，脂肪酸链上的基团随之暴露，因此在30 min后仍伴有小范围内的波动。这也表明通过运动参数的调节，体外仿生消化系统能够准确反映动态胃消化。

图2 不同时期胃内的pHFig.2 pH in the stomach at different times.

2.2.2 胃内MNPs的微观结构变化

用数码相机对胃中的消化物进行记录(图3-a)，观察其外观的变化，用光学显微镜观察鱼汤中MNPs的变化(图3-b～图3-h)。由图3-a可知，新鲜熬煮的鱼汤呈乳白色，随着消化过程的进行鱼汤从均一的乳白色逐渐变得澄清透亮，接近于胃液的颜色且并未发现明显的油水分层现象。这是由于在胃消化过程中，胃排空在连续性发生，胃中的鱼汤不断排向十二指肠且胃液不断对其进行稀释。从图3-b～图3-h可知，在胃消化过程中，MNPs的结构变化显著。在消化开始前，鱼汤中的MNPs均匀的分布在水相中，在消化10 min时，可观察到MNPs的外围膜发生破裂且相邻颗粒之间开始出现聚集性行为，这是因为MNPs是由天然的脂肪球膜包被，有蛋白质、磷脂、糖脂等[22]，胃蛋白酶将蛋白质水解，破坏了MNPs天然的膜结构，MNPs重新分布，发生聚集。这与LIANG等[23]发现牛乳经胃消化后的脂肪球粒径较消化前变大的研究结果一致。在20 min时，形成了不规则的球形且粒径变大;在消化进行到30 min时,可观察到规则的球形且外围变得清晰而完整。在接下来的消化过程中，可发现粒径较小的MNPs依然在不断靠近但MNPs的数量明显减少，这是由于胃排空的连续性发生且鱼汤被不断输送进来的胃液稀释。在消化进行到120 min时，从显微镜图中几乎已观察不到MNPs。

b-0 min;c-10 min;d-20 min;e-30 min;f-60 min;g-90 min;h-120 min图3 不同时期胃内消化物的相机图和光学显微镜图像Fig.3 Photograph and optical microscopy images of digest in the stomach at different times注:比例尺,20 μm(下同)

2.3 金枪鱼头汤在体外仿生消化系统中的肠消化

2.2.1 小肠内的pH变化

小肠在整个食物的消化吸收过程中占据着重要的地位，大分子物质在小肠中被彻底分解成小分子，随之被吸收。根据食物的性质不同，在小肠中的停留时间也不同，一般是3～8 h。胰液中的消化酶和胆汁在小肠消化过程中发挥着重要作用，其最适pH一般为7.0左右[20]，这也是静态实验简单的将小肠内的pH定为7.0或7.2的原因。为使小肠内的pH环境符合体内数据，在设备运行一开始就以0.9 mL/min的速度匀速向小肠内输送小肠液，使得在食糜进入小肠时，有适宜的pH环境。

图4为体外仿生消化系统在模拟小肠消化金枪鱼头汤过程中pH的变化。在小肠消化过程中，0 min的消化物是指在胃消化进行到6 min，通过胃排空由十二指肠进入小肠内的消化物。因此,小肠消化的起始pH接近于胃消化10 min时记录的pH 5.8，因为食糜刚进入小肠，还来不及与肠液发生中和且小肠中肠液数量有限。从图4可知，鱼汤在进入小肠进行消化的过程中，pH值从5.8(0 min)逐渐上升到6.9(30 min)，且在30 min后维持在6.9左右。符合人体小肠的消化环境，这也表明通过运动参数的调节，体外仿生消化系统系统能够准确反映动态肠消化。

图4 不同时期小肠内的pHFig.4 pH in the small intestine at different times

2.2.2 小肠内MNPs的微观结构变化

用数码相机对不同时期小肠内的消化物进行记录(图5-a)，观察其外观的变化，用光学显微镜观察鱼汤中MNPs的微观结构变化(图5-b～图5-h)。由图5-a可知，随着小肠消化时间的延长，消化物的颜色逐渐转变为与肠液类似的淡黄色，这与肠液的稀释有关。

b-30 min;c-60 min;d-90 min;e-120 min;f-150 min;g-180 min;h-210 min;i-240 min图5 不同时期小肠内消化物的相机图和光学显微镜图像Fig.5 Photograph and optical microscopy images of digest in the small intestine at different times

由图5-b～图5-h可知，消化30 min开始，大粒径的脂质聚集体开始裂解，中间出现间隙，消化进行到60 min时大脂滴旁边出现了明显的完整的球形颗粒，这与姚云平等[24]研究发现牛乳经过1 h的肠液消化后，可以观察到中间有空隙的边缘完整的脂肪球颗粒一致。胃中聚集的大颗粒在小肠中开始裂解的原因可能有2方面：一是由于胆汁的乳化作用，胆盐的加入使得脂肪的表面张力降低，使脂肪球乳化成小的液滴[20]；二是由于在模拟小肠的动态消化过程中，机械力的挤压，使得MNPs破散开。在消化时间为210 min时，光学显微镜图中已经观察不到明显的球形颗粒，但还可以观察到一些点状物，可能是由于脂肪还未被完全降解，或者可能来源于加入到肠液中的胆盐、磷脂和脂肪酸等形成的胶束。

3 结论

本文通过优化体外仿生消化系统的运动参数探究了金枪鱼头汤在动态胃肠道消化过程中的微观结构变化。结果表明， 通过优化设备的运行参数，可以使体外仿生消化系统准确反映动态胃肠道消化过程。金枪鱼头汤在体外仿生消化系统的胃消化过程中，MNPs膜上蛋白质降解，膜破裂，MNPs发生聚集性行为，并在消化进行到30 min时重新形成规则的球形，到120 min时，MNPs消失，胃消化结束。同时，在胃中形成的大粒径聚集体通过胃排空进入小肠后，开始发生裂解，当消化到60 min时形成了粒径较小的完整的球形颗粒并在210 min时消失。