PD-1/PD-L1通路在三阴性乳腺癌预后预测及治疗中的意义

张凤春 ，张硕渊，陈天恩，徐迎春

1. 上海交通大学医学院附属苏州九龙医院肿瘤科，苏州 215021；2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院肿瘤科，上海 200025；3. 上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤科，上海 200127

乳腺癌是危害全球女性健康的常见恶性肿瘤，其中的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），即雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR） 及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均为阴性的乳腺癌亚型，占全部乳腺癌的15%～20%[1]。TNBC对内分泌治疗和抗HER-2靶向治疗不敏感，缺乏有效的治疗靶点，是乳腺癌中较为凶险和预后较差的亚型，临床上急需寻找更为有效的新型治疗措施。

TNBC具有较多的肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TIL）[2]，高基因组具不稳定性[3]和较高的突变率[4]，使其可以产生较多的新抗原而成为最具免疫原性的乳腺癌亚型。程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）受体是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，由于其与细胞凋亡程序相关而被命名，多表达于激活的T细胞、B细胞及自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）。PD-1及其配体程序性死亡配体-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、PD-L2通 过 负 性信号调节T细胞的活化、免疫耐受以及免疫介导的组织损伤[5]。PD-L1是B7家族的一员，为跨膜蛋白，广泛表达于免疫细胞、上皮细胞及血管内皮细胞[6]。许多肿瘤细胞表面也表达PD-L1或在γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）诱导后高度表达PD-L1；当其与受体PD-1结合时，导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃避免疫监控[7]。通过抗PD-1/PD-L1单克隆抗体（单抗）阻断PD-1/PD-L1途径可以达到抗肿瘤的效果，为进行抗肿瘤免疫治疗提供了可能[8]。目前PD-1/PD-L1相关的研究已经成为肿瘤治疗研究的热点，在TNBC治疗领域也初露锋芒并广泛开展。PD-L2多表达于巨噬细胞和树突状细胞，也表达于肿瘤细胞。相对而言，PD-L2的功能研究尚不成熟。有研究[9]提示PD-L2在抗肿瘤免疫的诱导及效应阶段均可以促进CD8阳性T细胞发挥作用。本文着重概述目前PD-1/PD-L1在TNBC预后预测和治疗中应用的研究进展，以期为基础和临床研究提供理论基础。

1 PD-1/PD-L1在TNBC中的表达及其与预后的关系

肿瘤组织PD-L1阳性的恶性肿瘤患者预后较差。一项关于乳腺癌的meta分析[10]提示肿瘤细胞PD-L1阳性与不良临床病理危险因素（如分级为3、高增殖指数、激素受体阴性和TNBC）有关，且与无病生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）短密切相关；TIL的浸润程度与早期TNBC的DFS和OS相关，同时TIL PD-L1阳性亚组具有更长的DFS和OS；提示PD-L1具有一定的预后预测价值，且不同组织细胞PD-L1的预测意义可能存在差异。现有文献中关于在乳腺癌中如何用免疫组织化学方法检测PD-1及PD-L1表达的表述各异，其对预后预测结果往往也不一致，推测可能由于不同研究应用免疫组织化学检测的抗体种类不同[11]，PD-L1阳性阈值、靶细胞类型（肿瘤细胞、肿瘤间质细胞）、阳性表达细胞组分（细胞膜、细胞质）不同，及乳腺癌本身高度的异质性所致[12]。

1.1 PD-1/PD-L1在TNBC中的表达

2014年，Gatalica等[13]的研究纳入了116例乳腺癌患者（含53例TNBC），应用B7同源物1（B7 homologue 1，B7-H1，又称PD-L1）抗体，以1%中等或强的细胞膜或细胞质染色作为阳性，结果提示TNBC中TIL的PD-1及肿瘤细胞PD-L1的表达均明显高于HER-2阳性（n=5）、管腔B（n=25）和管腔A（n=33）亚型；相较其他3种乳腺癌亚型，TIL的PD-1及肿瘤细胞PD-L1共表达的比例亦以TNBC为最高，差异均有统计学意义。2017年，Dill等[14]采用组织芯片技术，以PD-L1细胞膜着色≥1%定义为阳性，检测了245例原发性乳腺癌（其中32%为TNBC）和40例转移性乳腺癌（淋巴结转移及远处转移各20例），结果显示PD-L1的表达在不同乳腺癌亚型及肿瘤内存在异质性，主要存在于组织学级别高、激素受体阴性的乳腺癌中。而Mittendorf等[15]以组织芯片的方法，选用PD-L1的5H1抗体检测了105例TNBC中PD-L1的表达，以阳性细胞＞5%作为界值，发现PD-L1阳性率为19%（20/105）。Dill等[14]的研究发现PD-L1弥漫性着色（＞50%）非常罕见，在全部乳腺癌中仅占2%，在TNBC中仅占5%；由此可见，PD-L1在肿瘤内的表达存在明显的异质性，粗针穿刺活检的PD-L1状态评价可能存在误判，提倡应用手术组织标本进行PD-L1检测。

实际上对于TNBC PD-L1检测的争议终于在IMpassion130研究[16]结果报道后尘埃落定。该研究对614例TNBC同时对PD-L1的SP142、22C3和SP263抗体进行检测；对于SP142和SP263抗体，将PD-L1阳性定义为任何强度PD-L1染色的肿瘤浸润免疫细胞（immune cell，IC）占肿瘤区域（肿瘤细胞、肿瘤内和肿瘤周围基质）面积的比例≥1%；对于22C3抗体，采用联合阳性评分（combined positive score，CPS）对PD-L1的表达进行判断，即PD-L1染色的细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞）数目相对于肿瘤细胞总数的百分比，将CPS≥1定义为22C3+。结果显示：3种抗体检测的PD-L1阳性率分 别 为 46%（SP142）、81%（22C3） 和 75%（SP263）。一致性分析发现：SP142+/22C3-为1%，SP142+/22C3+为45%，SP142-/22C3+为 36%，SP142-/22C3-为 18%； 而SP142+/SP263-为 1%，SP142+/SP263+为 45%，SP142-/SP263+为 30%，SP142-/SP263-为 24%； 提 示 22C3和SP263检测方法筛选出了较大的可能免疫治疗获益人群，而SP142检测方法阳性患者仅为上述2种检测方法阳性患者的一部分。探索性分析发现，SP142 IC阳性亚组与临床疗效相关，因此，SP142 IC检测方法已经被批准作为诊断性检测，以甄别最有可能从阿替珠单抗和纳米白蛋白结合型紫杉醇联合治疗中获益的TNBC患者（22C3+/SP142+和SP263+/SP142+人群）[16]。

1.2 PD-1/PD-L1与TNBC的预后

关于PD-1及PD-L1与临床病理特征关系的研究，Muenst等[17]的研究发现650例乳腺癌（TNBC 127例）中PD-L1阳性表达率为23.4%，其表达与年龄，肿瘤大小、分期、分级，淋巴结转移状态，雌激素受体（estrogen receptor，ER）缺失和增殖细胞核抗原Ki-67高表达相关。另有研究[18]亦支持PD-L1表达与高TIL水平及其他预后不良因素，如年轻、高组织学分级、ER阴性、孕激素受体（progesterone receptor，PR）阴性、HER-2过表达、高增殖指数及侵袭性亚型（三阴性、基底细胞样）等相关。

关于PD-1及PD-L1与预后关系报道不一。Monneur等[18]报道PD-L1表达是一个独立的影响患者OS的不良因素，亚组分析提示在以TNBC为主的基底细胞型中这种影响更为显著。一组来自870名中国乳腺癌患者（包含222例TNBC）的研究[19]数据亦支持PD-L1的高表达会对乳腺癌的预后产生不良的影响。另有研究[20]表明，新辅助化学治疗（化疗）后未达到病理学完全缓解的残留肿瘤组织中PD-L1的表达与局部晚期乳腺癌较差的预后有关，尤其是TNBC亚型。2017年有文献[21]报道了PD-L1和TILs联合分析在TNBC中的关系，证实在PD-L1阳性患者中如果同时伴有TILs低浸润则具有更高的复发和死亡风险。2018年Tomioka等[22]的研究获得类似结果，他们应用免疫组织化学方法检测了22例TNBC患者新辅助治疗前后肿瘤细胞PD-L1的表达；空心针穿刺活检的标本中，13例阳性率低于10%，9例阳性率高于10%；新辅助治疗后的手术标本中，19例阳性率低于10%，3例阳性率高于10%，提示新辅助治疗下调了PD-L1表达。该研究[22]同时检测了肿瘤微环境中TIL的分布，结果提示在TIL小于30%的亚组，新辅助治疗前PD-L1高表达（高于10%）者预后不良，DFS和OS较PD-L1低表达者明显下降。2017年的一篇纳入8 583例各亚型乳腺癌患者的meta分析表明，PD-L1过表达与无转移生存、DFS并无关系，但是与OS有显著关联，提示PD-L1过表达可能会增加病死率[23]，其机制可能为PD-L1的高表达可促进乳腺癌细胞的免疫逃逸[24]。

然而也有研究[25]发现，PD-L1对于TNBC的预后是一个积极的影响因素。2016年Bae等[26]的研究证实，PD-L1的表达有利于乳腺癌患者（TNBC 109例，占23.4%）的PFS和OS，但该因素不是一个独立的预后影响因素。同年又有研究[27]表明，尽管PD-L1的表达与乳腺癌不良的临床及病理特征相关，但是更有利于OS。另一项基于136例TNBC的研究[28]也提示间质中PD-L1阳性表达组与阴性表达组相比，DFS明显延长。此外，在包含238例TNBC的研究[12]中也发现肿瘤细胞中PD-L1的表达对于DFS是一个积极的影响因素，PD-L1阳性组的DFS明显延长，但PD-L1表达与OS无关。一项纳入45例乳腺癌患者（包含TNBC 15例）的研究[29]中，全部乳腺癌患者中78%存在TILs PD-L1阳性，而只有21%存在肿瘤细胞PD-L1阳性；在PD-L1阳性表达的肿瘤中，存在TILs浸润和存在外周血淋巴细胞活化的比例远高于PD-L1阴性表达组（89% vs 24%，100% vs 41%），说明肿瘤细胞的PD-L1表达可提示乳腺癌的免疫活化状态，部分解释了其作为一个预后良好因素的机制。PD-L1广泛表达于TNBC细胞膜（64%）、细胞质（80%）和间质（93%）；细胞质PD-L1高表达与低TNBC特异性死亡风险相关（HR=0.450，P=0.035），而间质PD-L1高表达与低全因死亡风险相关（HR=0.305，P=0.004），细胞膜PD-L1表达与预后不相关[30]。乳腺癌原发及转移病灶标本具有不同的免疫原性[31]。TNBC原发病灶PD-L1阳性率与转移病灶比较可能存在一定差异。

综上，PD-1/PD-L1对于TNBC预后的预测有着重要的作用，但TNBC本身具有较大的异质性，该预测作用在不同亚型中可能存在差异。现有的研究报道争议颇多，且还有研究[32]依据免疫细胞活化或抑制相关的29个基因（如CD8A等）将TNBC划分为免疫原性高、中、低不同亚组以预测免疫治疗效果，但这些研究和分型还有待进一步临床验证。

2 PD-1/PD-L1在TNBC中的表达及其与疗效的关系

对于TNBC患者，目前的主要治疗方案还是以手术和化疗为主。由于TNBC及其微环境中具有相对高的PD-L1水平，以PD-1/PD-L1为靶点的临床免疫治疗已经成为TNBC抗肿瘤治疗的新趋势[33]。Hartkopf等[34]在2016年的研究中证实，阻断PD-L1的治疗对于TNBC亚型有利于长期疾病控制。目前，已有多个抗PD-1、PD-L1及细胞毒T淋巴细胞相关抗原 -4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）的单抗及其联合治疗进入临床试验。现在已有5个PD-1/PD-L1通路相关的临床药物，分别是抗PD-1的Pembrolizumab、Nivolumab和抗 PD-L1的Atezolizumab、Avelumab和 Durvalumab；涵盖了新辅助治疗、辅助治疗和解救治疗等层面，甚至应用于一些特殊类型少见群体，如脑转移患者群等，从而使更多TNBC患者的临床免疫治疗获益成为可能。

2.1 单药治疗

初期的临床探索多集中于免疫单药治疗多线治疗失败以后的晚期TNBC。Pembrolizumab的Ⅰ b期多中心临床试验 KEYNOTE-12（NCT01848834）[35]为转移性 TNBC的治疗带来了突破；TNBC作为研究中一个队列，共计111例进行了PD-L1表达筛查，58.6%的患者为PD-L1阳性；最终32例入组，87.5%曾接受过新辅助化疗或辅助治疗，46.9%的患者接受了至少3线解救化疗，25.0%的患者接受过至少5线治疗，Pembrolizumab（剂量10 mg/kg，每2周1次）中位给药剂量为5 mg/kg（1～36 剂），中位持续时间为59.5 d（1～530 d）；在27例可评估疗效的患者中，客观缓解率（objective response rate，ORR）为18.5%（5/27），完全缓解率为3.7%（1/27），部分缓解率为14.8%（4/27），疾病控制率25.9%（7/27），疾病进展率为74.1%（20/27），实现缓解的中位时间为17.9周（范围7～32周）；常见的不良反应为轻度的疲劳、恶心和关节肌肉疼痛，32例患者中有5例出现了3度毒性反应，1例死于治疗相关的弥漫性血管内凝血。KEYNOTE-012为PD-L1阳性复发难治的TNBC免疫治疗进行了初步探索，临床获益25.9%（7/27）[35]，不良反应可耐受。此后开展的Ⅱ期临床研究KEYNOTE-086[36]纳入转移性TNBC 170例，其中PD-L1阳性占61.8%，接受3线及以上治疗占43.5%，每3周静脉注射Pembrolizumab 200 mg连续2年；结果提示：总体和PD-L1阳性患者的ORR为5.3%、5.7% ，疾病控制率分别为7.6%、9.5%；PD-L1表达与否与Pembrolizumab疗效无显著相关性；无治疗相关死亡，显示其在TNBC免疫治疗具有初步疗效和可控的安全性。Pembrolizumab对比单药化疗用于二线及以上TNBC的Ⅲ期随机对照临床研究（KEYNOTE-119）[37]结果显示，与化疗相比，Pembrolizumab并未显著改善患者的OS，但PDL1 CPS≥20%的亚群（占18.5%）的OS明显提高，差异具有统计学意义（HR=0.58，95% CI为0.38～0.88）。

2015年美国癌症研究学会年会公布了Atezolizumab治疗（15或20 mg/kg，每3周1次，持续1年）转移性TNBC的多中心Ⅰ期临床研究（NCT01375842）的进展：截至2014年7月21日，入组27例，21例可评估疗效，ORR 24%，3～5级不良反应发生率为11%，其中1例为5度肺动脉高压[38]。该研究[38]中，PD-L1阳性定义为IC占比≥5%。扩大样本量的研究[39]后续发布于2017年美国癌症研究学会年会，共计入组了115例TNBC，112例可评估疗效，含一线治疗19例、二线及以上治疗93例；依据实体肿瘤疗效评价标准，共11例（10%）患者对治疗有应答，而在PD-L1阳性亚组（IC评分2/3）中应答率提高至13%（9/71）；对Atezolizumab治疗有/无应答者的OS存在差异，且对Atezolizumab治疗有应答者的中位缓解持续时间长达21个月；提示Atezolizumab治疗对于一线及多线治疗后的部分TNBC均可能产生持久的治疗应答，并且具有较好的安全性，为免疫治疗在TNBC患者中的治疗应用提供了更多的证据。在2018年关于抗PD-L1单抗临床Ⅰ期试验（NCT01772004）的报道[40]中，Avelumab在58例TNBC患者中的ORR仅为5.2%，但在9例PD-L1阳性表达的TNBC患者中，ORR可高达22.2% 。

以上临床试验都提示在一定程度上抗PD-1/PD-L1单抗对于TNBC具有缓解作用。PD-L1高表达及TIL阳性[41]可能是免疫检查点抑制剂治疗有效的辅助筛选指标。但抗PD-L1抗体在治疗癌症的过程中由于激活免疫系统所导致的自身免疫疾病[42-43]及其他不良反应需引起重视。

2.2 联合治疗

在实验室研究和临床应用中，单一免疫检查点抑制剂的ORR并不令人满意。故先采用放射治疗（放疗）或化疗诱导治疗，或同步采用放疗、化疗和靶向治疗等，促进肿瘤细胞坏死后新抗原释放，以期改善患者的免疫治疗反应率。

TONIC研究[44]先采用放疗或多柔比星、环磷酰胺、顺铂化疗诱导治疗，然后给予抗PD-1药物Nivolumab治疗（3 mg/kg，每2周1次），与未处理直接免疫治疗组相比，多柔比星诱导组的ORR最佳（达35%），其次为顺铂组（达23%）；肿瘤组织中的CD8阳性的T淋巴细胞比例越高，免疫治疗的缓解率越高。Atezolizumab联合白蛋白紫杉醇治疗33例TNBC的Ⅰ b期临床研究（NCT01633970）报道联合治疗总ORR 42%，一线治疗、二线治疗的ORR分别为54%、30%[45]，提示免疫治疗早期应用可得到更大获益。一项来自41个国家的Ⅲ期临床试验（IMpassion130）[46]中，902名未接受过治疗的转移性TNBC患者被1:1随机分组，接受Atezolizumab或安慰剂联用纳米白蛋白结合型紫杉醇治疗，结果显示：Atezolizumab联合治疗组（试验组）的中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）为7.2个月，安慰剂联合治疗组（对照组）为5.5个月，Atezolizumab联合治疗组的疾病进展或死亡风险降低20%；试验组和对照组的中位OS分别为21.3个月和17.6个月，试验组的死亡风险降低16%。在共计369名PD-L1阳性（PD-L1 IC阳性率≥1%）的患者中，试验组和对照组的中位PFS分别为7.5个月和5.0个月，试验组的疾病进展或死亡风险降低38%；2组中位OS分别为25.0个月和15.5个月，试验组的死亡风险降低38%。此外，试验中没有发现新的不良反应。与标准治疗单独化疗相比，该研究[46]首次证明了免疫疗法和化疗联合能够显著延长生存期。在新辅助治疗的I-SPY 2临床试验中，Pembrolizumab联合标准化疗显著提高了TNBC患者的肿瘤反应率，与接受标准治疗的患者对比，Pembrolizumab联合治疗组的病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）由20%提高到60%[47]。另一项多中心前瞻随机双盲安慰剂对照Ⅱ期研究（NCT02685059）中，174例早期TNBC患者（其中117例参与窗口期）被1:1随机分组，给予纳米白蛋白结合型紫杉醇＋表柔比星＋环磷酰胺标准术前新辅助化疗，每4周给予Durvalumab或安慰剂，结果显示：Durvalumab组pCR为53.4%，安慰剂组为44.2%（OR=1.45，P=0.287）；对于参与窗口期患者，Durvalumab组与安慰剂组pCR分别为61.0%与41.4%（OR=2.22，P=0.048）；结果表明，蒽环类联合紫杉类新辅助化疗＋Durvalumab可以提高患者的pCR，尤其是化疗开始前单用Durvalumab治疗的患者[48]。此外，在一项Ⅲ期随机双盲试验（KEYNOTE-522，NCT03036488）[49]中，新辅助Pembrolizumab联合化疗组（KEYTRUDA方案，n=401）与新辅助化疗组（化疗-安慰剂方案，n=201）比较，pCR显著增加（51.2% vs 64.8%，P=0.001）；在无事件生存率（event free survival，EFS）方面，中位随访时间15.5个月时，与化疗-安慰剂方案相比，KEYTRUDA方案将新辅助期进展和辅助期复发的风险降低了37%（HR=0.63） 。旨在探索Pembrolizumab与化疗药物在新辅助治疗中的疗效和安全性的研究（Keynote 173与Keynote 522）仍在进行中（NCT02622074）。

目前，免疫治疗联合放疗（NCT02730130、NCT02303990）、联合化疗（NCT02499367）、联合靶向HER-2治疗（NCT03168880）、联合其他免疫治疗（NCT01928394、NCT02475213）、联合MEK1/2抑制剂治疗（TBCRC047）及联合聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂靶向治疗（DORA、MEDIOLA、 TOPACIO）的临床试验正在进行中；免疫治疗联合放疗（NCT02303366）、联合靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治疗（NCT00733408）、联合其他免疫治疗（NCT02381314）的临床试验已结束，结果待后续公布。靶向调节T细胞的新型免疫治疗药物的临床研究也正在进行中，如：抗PD-L1+激动剂4-1BB（CD137）或激动剂OX40治疗TNBC 的Ⅰ b/Ⅱ期临床研究（NCT02554812）、CA-170 [抗PD-L1/PD-L2、抗T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂（V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA） ] 治疗TNBC的Ⅰ期临床研究（NCT02812875）以及抗-LAG-3+紫杉醇用于转移性乳腺癌的Ⅱb期临床研究（NCT02614833）。

3 总结

综上所述，PD-1/PD-L1作为肿瘤研究领域的一个热点，因为其在肿瘤细胞表面的高度表达和对T细胞的调控，使得其成为一种治疗癌症的新的突破点。其既可以作为药物靶点，也可以作为一项可能的预后指标应用于TNBC。虽然目前对于PD-1/PD-L1 在TNBC等癌症中的研究和临床应用越来越多，但是不可否认其中存在一些待解决的问题。首先，免疫相关的不良反应可累计多个系统，主要为皮肤、消化道、肝脏、内分泌以及呼吸系统，其中以皮肤出现不良反应最为常见。在临床应用时，要严格控制剂量并及时监测患者的治疗情况，如有必要给予糖皮质激素等免疫抑制剂来防止严重并发症的发生。其次，不同肿瘤患者对于抗PD-L1 单抗治疗的反应不同，预后效果和PD-L1 在肿瘤细胞中的表达没有绝对关系，尚没有一个有效的指标去监测患者治疗反应，今后的临床研究将更为关注疗效预测标志物的探索。最后，抗PDL1 抗体治疗TNBC还处在一个起步阶段，多为Ⅰ/Ⅱ期探索性研究，主要集中于复发转移晚期患者，最有效的剂量和是否需要联合其他化疗药物，对于新辅助及辅助阶段应用的可行性等都需要更多的研究和临床实验才能证实。