巨噬细胞在脊髓损伤后自我修复中的作用及其治疗应用进展

林俊卿，郑宪友，鲍丙波，李星玮，高 涛，黄腾立

上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海200233

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是骨科临床上常见的一种创伤性疾病，由于脊髓的完整性及连续性受到外力破坏而导致机体感觉、运动及自主神经障碍。据统计，世界范围内共有超过2 000万的患者正遭受着脊髓损伤所带来的痛苦，并以每年约70万人的速度增长[1]。相关研究[2-3]报道，我国有超过100万患者正遭受着脊髓损伤疾病的困扰，并以每年1万～6万人的速度增长。脊髓损伤的“三高一低”（高发病率、高致残率、高耗费及低龄化）特点，给整个社会带来了巨大的负担。脊髓损伤后的炎症反应是损伤修复过程中的第一步，大量关于创面愈合的研究对炎症在伤口愈合中的作用进行了详细阐述，明确了巨噬细胞在创面修复中发挥的关键作用[4]。同时也有大量的研究对巨噬细胞在脊髓损伤中的作用进行探讨，并提出了通过对不同种类巨噬细胞的干预，以缓解炎症从而促进脊髓损伤修复的观点[5]。本文总结了不同种类的巨噬细胞在脊髓损伤后自我修复过程中发挥的作用及机制，并对目前通过干预巨噬细胞治疗脊髓损伤的最新进展进行综述。

1 参与脊髓损伤后自我修复中的巨噬细胞种类及其作用机制

脊髓损伤后随即出现大量的炎症细胞浸润，其中巨噬细胞为炎症反应中关键细胞之一。巨噬细胞往往在SCI后的1 d开始浸润，7 d时达到顶峰并持续存在。不同的巨噬细胞在脊髓损伤过程中的作用不尽相同[5]。

1.1 M1型巨噬细胞

M1型巨噬细胞是一种巨噬细胞亚型，又称为经典活化型巨噬细胞，主要通过吞噬死亡细胞或组织碎片，并释放大量炎症因子募集更多炎症细胞局部浸润而发挥作用[6]。单核细胞经过脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）刺激能够从M0型巨噬细胞极化为分化抗原68 （cluster of differentiation 68，CD68）、组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）及CD80特异性标记M1型巨噬细胞[7]。位于损伤部位脊髓组织中的胶质细胞（少突胶质细胞、星型胶质细胞等）在早期便开始活化，随后释放大量的细胞因子及趋化因子。12～24 h内，中性粒细胞第一时间向损伤部位募集，其释放的大量细胞因子进一步加剧血脊髓屏障的破坏，使得M1型巨噬细胞不断向损伤中心募集浸润[8]。浸润的M1型巨噬细胞在损伤部位吞噬大量的髓鞘碎片及崩解的神经元细胞。Burda等[9]认为，炎症反应在脊髓损伤中具有两面性，过多的M1型巨噬细胞作用会使损伤周围环境紊乱，进一步加剧脊髓的损伤，但M1型巨噬细胞作用过少会导致坏死组织堆积过多，这同样不利于损伤脊髓的修复。因此在脊髓损伤的早期阶段，M1型巨噬细胞的作用在一定程度上有利于局部损伤组织的康复。这一观点也在皮肤创面愈合中得以验证[10]。在创面愈合过程中，M1型巨噬细胞在浸润后的1～3 d开始逐渐减少，炎症反应随之减弱。但在脊髓损伤后，组织中的M1型巨噬细胞迟迟不能得以清除。在急性期、亚急性期甚至是慢性期依旧会有M1型巨噬细胞浸润[11]。M1型巨噬细胞长期浸润引起的持久炎症反应可能是导致脊髓损伤后无法完全修复的机制之一。

脊髓损伤后，M1型巨噬细胞吞噬坏死物质并刺激核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、 信 号转导与转录激活蛋白1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）及干扰素调节因子5（interferon regulatory 5，IRF5）等信号通路，活化并释放大量的白介素 6（interleukin 6，IL-6）、白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor，TNF-α）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等炎症因子，进一步加重炎症细胞募集。TNF-α作为M1型巨噬细胞在脊髓损伤后分泌的主要细胞因子，通过激活NF-κB加剧炎症反应，同时使周围细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)表达上调并诱导周围细胞发生凋亡，不利于受损脊髓组织修复[12]。由于TNF-α的大量分泌，蛋白酶体的清除增加，NF-κB通路的激活，导致iNOS释放增加[13]。iNOS具有影响神经细胞活性的作用并进一步加剧炎症因子的富集，如多米诺骨牌式造成脊髓损伤后的“炎症瀑布”效应，对周围未受损的脊髓组织带来巨大的损伤。此外，M1型巨噬细胞还能释放IL-1β等炎症因子，同时具有激活Th1细胞的作用从多方面加重脊髓损伤后的细胞损伤，不利于组织的恢复。总之，M1型巨噬细胞在脊髓损伤早期，虽发挥了清除坏死组织的作用，但却引起“炎症瀑布”效应，致使更多的组织出现损伤，因此减少M1型巨噬细胞的浸润或许是今后通过干预免疫来治疗脊髓损伤的方式之一。

1.2 M2型巨噬细胞

M2型巨噬细胞为巨噬细胞另一种亚型，又被称为抗炎型巨噬细胞，在组织损伤后其能够向M2a、M2b及M2c型巨噬细胞极化。不同亚型的M2型巨噬细胞在脊髓损伤过程中发挥其独特的作用。

1.2.1 M2a型巨噬细胞 M2a型巨噬细胞是一种高水平表达精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）及Ym1的M2型巨噬细胞亚型，IL-4及IL-13能够诱导单核细胞极化形成M2a型巨噬细胞[14]。脊髓损伤后伴随血脊髓屏障的破坏，大量骨髓来源的单核细胞募集到损伤区域形成M1型巨噬细胞。Kigerl等[15]的研究发现，在脊髓损伤修复中，M1型巨噬细胞的大量浸润往往伴随着M2a型巨噬细胞浸润。Gensel等[5]证实此现象也同样发生于创面修复中。该种巨噬细胞能够通过分泌Arg-1及髓系细胞表面触发受体 2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）等因子控制局部炎症反应，分泌胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor，IGF-1）及转化生长因子（transforming growth factor，TGF-β）等生长因子促进局部组织生长。此外其还具有稳定局部血管及促进胶原沉积的作用[16]。M2a型巨噬细胞在创面愈合及脊髓损伤的过程中都起着抗炎的作用，同时该类细胞在创面及脊髓损伤的愈合中具有启动损伤部位修复的能力。但目前损伤脊髓组织中的M2a型巨噬细胞来源依旧不明确。新近研究认为M2a型巨噬细胞可能由M1型巨噬细胞转化而来。Ghosh等[17]的研究中发现在脊髓损伤中，cAMP及IL-4在M1向M2a型巨噬细胞的转化中起到关键作用，联合使用2种细胞因子进行刺激能够很好地使M1型巨噬细胞转化为M2a型巨噬细胞。M2a型巨噬细胞在SCI中如来源、作用机制等问题目前还未能得到深入阐明。

1.2.2 M2b型巨噬细胞 M2b型巨噬细胞是以释放大量的IL-10为特征的一种M2型巨噬细胞亚型，又称为调节型巨噬细胞，通过刺激Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）使M0型巨噬细胞向M2b型巨噬细胞转化。在组织修复的过程中，M2b型巨噬细胞作为修复期主要的巨噬细胞类型，通过释放大量的IL-10抵制组织炎症反应以起到组织修复的作用。相关研究发现脊髓损伤后IL-10的表达在3 d后开始下降，并在7 d时到达低谷。而Novak等[18]认为，在创面愈合后的第7日IL-10的表达水平达到最高峰值。2种研究结果的差异说明脊髓损伤后M2b型巨噬细胞较少活化，这或许是导致损伤组织不能顺利修复的又一原因。

1.2.3 M2c型巨噬细胞 M2c型巨噬细胞为M2型巨噬细胞的一种亚型，作为组织重塑期中重要的细胞之一，具有TGF-β分泌增加、CD206表达上升及Arg-1表达下降的特征。在组织损伤过程中，M2c型巨噬细胞通过释放基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-8，MMP8）、多功能蛋白聚糖（polyclonal antibody to versican，VCAN）及TGF-β等因子促进局部组织重塑及增殖以达到组织修复的目的[19]。目前M2c型巨噬细胞在脊髓损伤中的报道较少，其是否具有与创面愈合类似的作用，有待进一步深入研究。

M2型巨噬细胞在脊髓损伤的过程中，由于种种原因，不易从单核细胞或M1型巨噬细胞转化形成，阻碍了损伤部位脊髓从炎症期顺利过渡到修复期。虽目前部分研究认为在脊髓损伤后的3d内会有M2型巨噬细胞出现[5]，但具体其在脊髓损伤后充当何种作用仍旧未知。因此，对于M2型巨噬细胞在脊髓损伤修复中的作用有待进一步研究阐明。

2 对巨噬细胞进行干预治疗脊髓损伤

巨噬细胞作为参与脊髓损伤修复的重要细胞类型之一，发挥了其清除坏死物质、促进组织修复的作用。但在SCI的自我修复中，M1型的巨噬细胞更多地引起脊髓二次损伤，阻碍脊髓的自我修复。同时，M2型巨噬细胞虽具有抗炎作用，但由于活化数量过少，其抗炎作用未能在SCI自我修复过程中得以体现。因此，如何抑制脊髓损伤后M1型巨噬细胞的炎症反应，同时促进M2型巨噬细胞数量的增多，有望成为治疗脊髓损伤新的突破点。

2.1 抑制M1型巨噬细胞的增殖及分化

脊髓损伤急性期，损伤部位浸润的巨噬细胞绝大多数为M1型巨噬细胞[15]。M1型巨噬细胞为导致脊髓损伤炎症反应的核心细胞。诸多研究[20]认为，通过抑制M1型巨噬细胞增殖及分化是潜在抑制急性期炎症反应方法。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）具有促进巨噬细胞的增殖及分化的作用。目前认为通过干预M-CSF受体能够抑制巨噬细胞的增殖，并阻碍“炎症瀑布”效应的发生，促进脊髓损伤的修复。但目前有研究[21-22]认为M-CSF具有一定的神经保护作用，阻断M-CSF后可能会对帕金森病、阿尔茨海默病等神经病理性疾病产生一定的影响。因此还需更多的研究对阻断M-CSF作用后抑制巨噬细胞增殖及分化、改善脊髓损伤后炎症反应进行验证。

2.2 抑制M1型巨噬细胞活化通路

M1型巨噬细胞在脊髓损伤后，通过分泌大量的TNF-α及IL-1β等促炎因子，局部炎症反应进一步恶化并导致严重的“炎症瀑布”效应。因此通过抑制巨噬细胞分泌的炎症因子，影响巨噬细胞活化通路，可起到抗炎作用。Peng等[23]及Khalatbary等[24]的研究认为在不同的动物模型中，阻断巨噬细胞分泌TNF-α有不同的效果，但在SCI后拮抗TNF-α能够显著改善脊髓损伤模型的预后。SCI后，TNF-α的表达在短时间内出现升高。Vidal等[25]的研究显示，延迟使用TNF-α拮抗剂对脊髓损伤后的修复并无作用。因此对TNF-α的干预应尽可能快地在脊髓损伤发生后进行[26]。除了直接采用拮抗剂阻断TNF-α外，还有其他方法包括减弱TNF-α的活性、阻断TNF-α靶向受体等方式来抑制M1型巨噬细胞活化通路。此外还能通过阻断IL-1β、iNOS等的促炎症作用，或通过抑制NF-κB活性等方式以抑制M1型巨噬细胞活化通路从而降低炎症反应。

2.3 促进损伤区域M2型巨噬细胞的浸润

脊髓损伤后，大量的M1型巨噬细胞在损伤部位浸润。由于脊髓的特殊性，M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化出现障碍，以此导致损伤区域的M1型巨噬细胞浸润增加，炎症因子不断分泌，并影响组织再生。诸多研究报道，M2型巨噬细胞在创面中起到促修复及重塑作用，但在脊髓损伤中M2型巨噬细胞数量较少、作用较弱，这或许是脊髓损伤不完全修复的原因之一。因此增加M2型巨噬细胞的数量有望成为脊髓损伤修复治疗的方法之一。

2.3.1 过氧化物酶体增殖激活受体-γ的作用 过氧化物酶体增殖激活受体-γ（peroxisome proliferater-activated receptor γ，PPAR-γ）与巨噬细胞胆固醇稳态及炎症反应密切相关。目前的研究认为激活PPAR-γ可用于治疗炎症性疾病，包括酒精性肝病及炎性肠病等[27-29]。研究证实，在脊髓损伤患者中使用PPAR-γ激动剂（如罗格列酮等）在体内及体外均发挥了神经保护作用。Bouhlel等[30]认为其保护作用可能是通过将M1型巨噬细胞向抗炎型M2型巨噬细胞转换实现，同时其还具有促进外周血单核细胞向M2型巨噬细胞转化的作用。Li等[31]研究者却认为，PPAR-γ激动剂在脊髓损伤的治疗中很可能是通过减少自噬而起到对神经的保护作用。此外，PPAR-γ激动剂还具有稳定脊髓损伤后线粒体的功能而起到对神经的保护作用[32]。PPAR-γ是否能够通过增加M2型巨噬细胞的浸润起到神经保护作用尚有待深入研究。

2.3.2 干细胞治疗 干细胞治疗成为目前SCI治疗的重要方向之一。大量的关于干细胞运用于治疗脊髓损伤的研究结果显示，干细胞治疗后能够有效地恢复脊髓损伤后的运动及感觉功能。Zhang等[33]研究认为，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有使得单核细胞极化为M2型巨噬细胞的能力从而起到抑制炎症并促进创面愈合的作用。Nakajima等[34]的研究显示，MSCs治疗组中，损伤部位M2型巨噬细胞增多，M1型巨噬细胞减少，这一现象与脊髓损伤后运动功能的恢复密切相关。除MSCs外，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）也被运用于脊髓损伤的治疗。研究表明，向损伤部位使用NSCs治疗后能够减少损伤部位M1型巨噬细胞的浸润及TNF-α等炎症因子的释放；此外通过改善局部微环境使得更多的M2型巨噬细胞浸润，以达到促进轴突出芽、功能恢复的目的[35-36]。干细胞外泌体近年来成为研究的热点内容之一。在脊髓损伤后，Sun等[37]将脐带来源的间充质干细胞外泌体用于脊髓损伤治疗后发现，其能促进骨髓来源的M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，此外还能下调如TNF-α等炎症因子的作用，从而达到促进脊髓损伤修复的目的。虽然干细胞及其外泌体在实验研究过程中都显示了其对脊髓损伤的治疗作用是通过促进M2型巨噬细胞浸润而实现的，但将其向临床转化仍有很长一段路要走，需要通过多方面的研究验证干细胞及其外泌体的安全性及有效性方可实现向临床应用转化。

2.3.3 相关炎症因子的干预 Bao等[38]的相关研究表明，脊髓损伤后，将IL-7受体阻断后能够调节Th1及Th2细胞的活性从而有利于巨噬细胞向M2型极化，并以此改善脊髓损伤后的功能。此外，将IL-6信号进行阻断后，能够在脊髓损伤后抑制M1型巨噬细胞活性，并促进M2型巨噬细胞激活，以达到减弱炎症反应并促进神经功能恢复[36]的作用。研究显示，使用胍丁胺能够使得损伤局部IL-10表达的上升，以此降低损伤部位的M1型巨噬细胞，并促进M2型巨噬细胞浸润，起到对脊髓损伤的修复[39]。

2.4 损伤部位移植M2型巨噬细胞

针对局部M2型巨噬细胞浸润较少的问题，诸多研究者对向脊髓损伤部位移植特定的M2型巨噬细胞是否有助于改善损伤后的脊髓功能及形态恢复这一问题进行探索。Ma等[40]在体外将骨髓来源的巨噬细胞诱导为M2型巨噬细胞输注回体内后发现其能够减少脊髓损伤的病灶大小，同时起到促进轴突髓鞘化及保护神经元的作用。此外Shechter等[41]的研究证明，M2型巨噬细胞的募集来源于血脑脊液屏障及脉络膜。脑脊液及脉络膜维持了M2型巨噬细胞的抗炎作用，通过向脑室内直接注射CD115单核细胞能够减小脊髓损伤病灶，并促进损伤后神经康复。该项研究为脊髓损伤后巨噬细胞移植提供了新的思路。但目前的研究并不完全支持移植M2型巨噬细胞具有促进脊髓损伤修复作用这一观点。Ren等[42]使用IL-4在体外诱导M2a型巨噬细胞后注入脊髓损伤部位，脊髓损伤后的运动及感觉功能并未恢复。因此移植M2型巨噬细胞是否能够治疗脊髓损伤有待进一步研究。

3 小结

巨噬细胞在脊髓损伤后的炎症反应中作为核心细胞起到了关键作用。不同种类的巨噬细胞在SCI中的功能不尽相同。目前的研究对巨噬细胞在脊髓损伤后的组成并没有完全阐明，M2型巨噬细胞在脊髓损伤中的来源、组成及作用也并未能得以完全揭示。此外，大量的研究通过干预巨噬细胞后起到了恢复脊髓损伤后神经功能作用，说明干预巨噬细胞可能成为潜在的治疗脊髓损伤修复的方法。通过对巨噬细胞在脊髓损伤修复中的作用的深入了解，可望为脊髓损伤的治疗带来新的契机。