涂阳肺结核患者γ-干扰素释放试验假阴性的影响因素分析

马进宝 马婷婷 任斐 杨翰 谭淦纹

γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)是一种基于人体细胞免疫应答机制，在体外用早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)刺激结核分枝杆菌抗原致敏的效应记忆T细胞释放相应的细胞因子，然后通过定量或定性分析系统检测细胞因子的释放含量变化情况，进而辅助诊断机体是否存在结核分枝杆菌感染的技术。相较结核菌素皮肤试验(TST)，IGRA具有检测快速及不受卡介苗(BCG)接种和非结核分枝杆菌感染影响的优势[1]，其在辅助诊断结核病时有较高的敏感度和特异度[2-3]。但是IGRA的检测结果可能受机体免疫力、疾病类型、T细胞功能的影响，从而出现假阴性。笔者通过对比IGRA检测阳性及假阴性涂阳肺结核患者临床资料，以期分析IGRA检测假阴性的影响因素，为临床判断IGRA假阴性结果及辅助结核病诊断提供参考。

对象和方法

1.研究对象：搜集2019年6—12月就诊于西安市胸科医院的196例痰涂阳肺结核患者作为研究对象，其中，男145例(74.0%)，女51例(26.0%)；年龄中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]为38(26，53)岁。按IGRA检测结果分为IGRA检测阳性组(106例)和假阴性组(90例)。本研究经西安市胸科医院伦理委员会审批，研究对象入组前均对其进行了充分的知情宣讲，并签署知情同意书。

2.纳入和排除标准：(1)纳入标准：①痰涂片抗酸染色阳性；②影像学可见肺部病灶。(2)排除标准：①最终确诊为非结核分枝杆菌病；②既往肺部基础疾病；③并发肿瘤、自身免疫性疾病、HIV感染及免疫抑制剂使用者。

3.资料收集：所有患者收集其一般资料[性别、年龄、卡介苗接种史、结核病史、是否并发糖尿病、结核病病程、是否对一线抗结核药品耐药、痰菌载量、体质量指数(BMI)]，临床症状(发热、咳嗽、咳痰、体质量减轻)，实验室检验资料[白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比、血红蛋白含量、血小板计数、血清总蛋白含量、血清白蛋白含量、血腺苷脱氨酶水平、血红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、总T淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞计数、CD8+T淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值，以及胸部CT表现(病灶累及肺野范围、肺部空洞数)。

4.IGRA检测：采用结核感染T细胞检测试剂盒(购自北京万泰公司)，该方法分体外抗原刺激全血培养释放γ干扰素(INF-γ)和用 ELISA法定量测定INF-γ 两步。采集研究对象静脉血4 ml，分装到背景管、检测管和阳性管各1 ml，于37 ℃培养(22+2) h，2200×g离心10 min，取上清液用ELISA方法检测，得到各管吸光度值(A值)，A值输入配套软件自动判读结果。在获得仪器结果时，观察阳性管是否呈阳性反应，若阳性则表示试验成功，若阴性则建议患者重新进行采样检测。在观察背景管A值过高时，为排除操作不当引起的阳性管交叉污染等原因，同样建议患者重新进行采样检测。

5.胸部CT扫描：采用美国GE公司Bright Speed Elite Select 16排CT机，受检者取仰卧位，头先进，于深吸气末屏气时自肺尖至肺底方向行全肺轴位平扫，层厚10 mm，层间距10 mm。由2位主治及以上职称的影像学医师对患者胸部CT表现进行判读，判读结果一致时记录结果，不一致时由副主任医师及以上职称的影像学医师一起商议决定。

结 果

1.单因素分析：196例研究对象中，IGRA检测阳性106例，阳性率为54.1%。对IGRA检测阳性组和假阴性组患者的一般资料、临床症状、实验室检查、胸部CT表现等共29个指标进行单因素分析，结果发现两组研究对象的BMI、白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、血红蛋白、血小板计数、血清白蛋白、ESR、CRP、CD4+T淋巴细胞计数等指标的差异有统计学意义，见表1。

2.多因素分析：以IGRA阳性组及IGRA假阴性组为因变量，将BMI、白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、血红蛋白、血小板计数、血清白蛋白、ESR、CRP、CD4+T淋巴细胞计数等进行多因素logistic回归分析(变量赋值见表2)，结果显示，白细胞计数≥7.0×109个/L、ESR≥40 mm/1 h、CD4+T淋巴细胞计数<400 个/μl是IGRA检测假阴性的独立危险因素，见表3。

表1 涂阳肺结核患者IGRA检测假阴性影响因素的单因素分析

续表1

表2 涂阳肺结核患者IGRA检测假阴性影响因素的多因素logistic回归分析变量赋值

表3 涂阳肺结核患者IGRA检测假阴性影响因素logistic回归分析

讨 论

确诊结核病需找到结核分枝杆菌病原学依据，方法包括涂片抗酸染色、分枝杆菌培养、分子生物学方法等。临床工作中有时因患者无痰或肺外结核限制了病原学依据的获得，导致结核病确诊困难。IGRA对潜伏结核感染(LITB)、活动性肺结核及疑似肺结核均有一定的诊断价值[4]，其通过血液标本进行检测，不存在标本获得困难问题，且IGRA检测活动性肺结核有较高的敏感度(74.6%～84.8%)[2,5-6]。刘佳文等[7]研究发现，IGRA检测菌阳肺结核的阳性率为74.1%。本研究中，IGRA检测痰涂阳肺结核患者的阳性率为54.1%，低于上述研究，考虑可能与以下因素有关：(1)试剂盒的检测性能及实验人员的操作误差引起；(2)国产试剂盒使用ELISA方法检测全血INF-γ，因血液成分复杂影响因素较多，且与传统的结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)相比，不能够刺激定量的T淋巴细胞来检测INF-γ释放水平，因此，导致阳性率明显低于T-SPOT.TB；(3)实验室的规范化操作及日常的质量控制是避免随机误差引起实验假阴性的有效手段，但并不能完全排除此因素的影响。

本研究通过分析可能影响IGRA检测假阴性的因素，发现白细胞计数升高、ESR升高、CD4+T淋巴细胞计数减少是IGRA检测假阴性的独立危险因素。INF-γ主要是由活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞等分泌[1]，其中，淋巴细胞和结核病的免疫有密切关系。Kwon等[8]通过多因素分析发现，淋巴细胞计数低于1.0×109个/L是IGRA检测假阴性的独立危险因素。张娟等[9]研究发现，T-SPOT.TB检测阴性患者淋巴细胞计数低于阳性患者。本次研究中，单因素分析也获得了相同结果。中性粒细胞在结核病固有免疫中发挥作用，其对结核病早期机体杀伤结核分枝杆菌及病情发展中免疫调节有重要作用[10]。中性粒细胞百分比升高可能预示结核病免疫尚处在固有免疫阶段，非特异性免疫应答水平不高。白细胞计数升高时，中性粒细胞百分比升高，而淋巴细胞百分比降低，导致INF-γ生成减少，白细胞计数变化可能同时体现了淋巴细胞及中性粒细胞对IGRA的影响。

ESR与结核病活动性密切相关[11]，其结果能够反映机体对结核病炎症反应程度。吴纯等[12]研究发现INF-γ释放水平与ESR呈负相关，与本研究结果相似。关于ESR与INF-γ释放水平研究较少。有研究显示，CRP升高与IGRA检测不确定性及假阴性结果相关[13-14]，提示患者高炎症水平可能与IGRA检测假阴性有关，本研究单因素分析显示ESR和CRP升高与IGRA假阴性相关，与文献结论一致。结核病机体免疫与T淋巴细胞密切相关，其中，以CD4+T淋巴细胞占主导[15]。既往研究CD4+T淋巴细胞与INF-γ释放水平有关[16-17]，CD4+T淋巴细胞数目与功能降低将直接导致INF-γ释放降低。另有研究表明，引起CD4+T淋巴细胞减少的临床因素可能导致IGAR检测假阴性，HIV感染者易并发结核分枝杆菌感染，HIV感染导致CD4+T淋巴细胞减少，HIV阳性的活动性肺结核患者应用IGRA检测的阳性率下降[18-19]。老年患者因其CD4+T淋巴细胞功能及数量降低易导致IGRA检测假阴性[13，20-21]。本次研究未能得出相应结论，可能与>65岁患者例数较少有关。因此，对于可能并发导致CD4+T淋巴细胞降低相关疾病的患者，当其IGRA检测阴性时应小心漏诊结核感染。

既往关于T-SPOT.TB检测结果的影响因素研究较多，而关于IGRA-ELISA法检测结果的影响因素研究较少，IGRA-ELISA法通过测定活化的T淋巴细胞释放INF-γ的量来衡量是否有结核感染，其假阴性影响因素可能与T-SPOT.TB不同，本研究结果显示白细胞计数升高、ESR升高、CD4+T淋巴细胞计数降低是IGRA检测涂阳肺结核患者出现假阴性结果的危险因素，为临床进一步判读IGRA检测结果提供了依据。本研究综合纳入患者一般资料、临床症状、实验室检验、影像学资料等进行多因素分析，更全面的纳入了可能影响IGRA假阴性的因素。本研究不足之处在于纳入分析因素多而纳入研究患者数有限，可能影响多因素分析结果。并发HIV感染可能与IGRA检测假阴性相关，因本地区HIV感染并发结核病的发病率低而未能纳入分析。此外，本研究以痰涂阳肺结核患者为研究对象，不能完全确定为结核分枝杆菌感染，但鉴于已排除部分经后续菌种鉴定为非结核分枝杆菌感染的患者，且西部地区非结核分枝杆病发病率低等因素，考虑其对研究结果影响较小。