艾司西酞普兰对MPTP诱导的急性帕金森病模型小鼠运动和认知功能的作用

苑晓阳 刘俊骞 顾平 刘惠苗 王文婷 仇福成 李冬 李娜

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元进行性减少为主要病理改变。临床主要表现为运动迟缓、静止性震颤、强直等多种运动症状，亦可伴发认知功能障碍、情绪障碍、睡眠障碍等多种非运动症状[1-2]。认知功能障碍是PD重要的非运动症状之一。认知功能损害在早期PD患者中发病率约为18.9%～38.2%，其中有70%～80%的PD患者最终进展为PD性痴呆，且以每年10%的速度进展[3]。运动和认知功能与PD患者的病情、生活质量及预后息息相关。因此，改善患者的运动及认知功能对减轻家庭和社会的照料以及经济负担有重要作用。草酸艾司西酞普兰(escitalopram，ESC)是西酞普兰的异构体，主要用于治疗广泛性焦虑、重度抑郁症及惊恐障碍等[4]。迄今为止，已有多项研究报道ESC在改善认知功能方面发挥重要作用[4-5]，但目前关于ESC对PD运动及认知功能影响的研究较少。因此，本研究对ESC对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4 -phenyl-1，2，3，6-tetrahydropridine，MPTP)诱导的急性PD模型小鼠运动和认知功能的影响进行探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：11周龄雄性清洁级健康C57BL/6J小鼠45只，体质量23～30 g，由北京华阜康公司提供。根据《河北医科大学动物管理条例》进行适宜室温、自由饮食水、标准昼夜节律喂养。

1.1.2主要试剂和仪器：MPTP(M0896)购自Sigma公司，ESC原研药由丹麦灵北药业提供；酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗体(ab137721)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗体(ab72439)和抗胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)抗体(ab70219)均购自abcam公司；β-actin(20536-1-AP)购自Proteintech公司；山羊抗兔荧光二抗(A23920-1)购自Abbkine公司；SABC免疫组化染色试剂盒(SA1022)购自博士德生物公司。Morris水迷宫来自上海欣软信息科技有限公司；自制爬杆；Olympus光学显微镜来自日本Olympus光学工业株式会社；Eppendorf5417R型号离心机来自德国艾本德公司；22br53450型号干转机及10025025Rev A型号电泳槽(含玻璃板套件)来自BIO-RAD公司；石蜡切片机来自德国Leia公司。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组及模型构建：将45只C57BL/6J小鼠按随机数字法随机分为3组：(1)急性PD模型组(PD组，n=15)：健康小鼠采用腹腔注射MPTP制作急性PD模型小鼠；MPTP溶于生理盐水(4 mg/mL)，按体质量20 mg/kg腹腔注射，每隔2 h注射1次共4次[6]；小鼠出现一过性的震颤、后腿拉直、躬背、竖毛、运动减少，并检测小鼠黑质及纹状体区域TH+细胞数减少最终确定模型构建成功。(2)正常对照组(对照组，n=15只)，采用上述相同方式给予健康小鼠同等剂量的生理盐水；(3)ESC预处理组(ESC组，n=15)：即在制备急性PD模型(同PD组)前3 d，每日上午9时按体质量15 mg/kg给予小鼠ESC腹腔注射1次，共注射12 d。

1.2.2认知行为学及运动功能检测：三组小鼠认知功能均通过Morris水迷宫实验定位航行试验和探索训练检测，运动功能检测均通过爬杆实验及Morris水迷宫实验游泳速度检测进行。

(1)认知功能：Morris水迷宫实验的所有实验均于黑暗环境下进行，关闭房间内所有灯，并将不透光窗帘全部拉上。实验开始前3 d行适应性训练以防小鼠产生焦虑或恐慌。

三组小鼠均于MPTP注射后第2天开始行水迷宫实验共5 d。①定位航行试验：通过对小鼠寻台潜伏期进行重复测量比较检测小鼠学习能力的变化。②探索训练：于水迷宫实验第6天撤掉平台，开始60 s的探索训练。记录小鼠在目标象限穿越平台的次数、穿越平台所在象限路程占总路程的比例(路程百分比)，以检测小鼠空间记忆的功能。

(2)运动功能检测：①游泳速度检测：Morris水迷宫运用计算机影像捕捉小鼠单位时间内的动轨迹，并记录小鼠游泳速度。②爬杆实验：参照文献[7]进行改良的爬杆试验。各组小鼠均于造模前3 d进行适应性训练，3次/d，每次间隔30 min。于造模后第8天检测各组小鼠运动能力，记录3次由顶爬行至底的时间并计算均值。

1.2.3LSAB免疫组化染色法：检测黑质TH+阳性神经元和纹状体平均光密度(mean optical density，MOD)，确定PD模型构建成功，对海马CA1区进行ChAT免疫染色确定ESC对PD模型认知功能的改善功能。制作急性PD模型第9天取每组5只小鼠用2%(0.02 g/mL)水合氯醛1.5 mL腹腔注射麻醉后，断头取脑。将全脑组织采取固定、脱水、浸蜡、包埋等步骤制备组织蜡块。用旋转切片机行黑质、纹状体和海马冠状位连续切片，厚度4 μm。选取各组小鼠黑质及纹状体部分，分别取头、中、尾端各取5张切片，以各组小鼠海马CA1区相同位置的切片取5张共45张脑片，经脱蜡，脱水，热修复，双氧水室温孵育，封闭液封闭30 min。黑质和纹状体切片加TH抗体(1∶2000)，海马切片加入兔血清ChAT抗体(1∶2000)，4℃孵育过夜。山羊抗兔IgG室温孵育30 min，封闭20 min，DAB法显色，水洗后切片经苏木素着色，再水洗，1%盐酸酒精脱色，水洗，氨水复染，水洗，梯度酒精(70%～100%，从低至高)脱水，二甲苯固定10 min×2，中性树胶封片。使用BX60显微镜，SPOT-2数码成像软件，在400倍视野下对含完整细胞核的黑质TH+和海马CA1区ChAT+的细胞进行计数，计算黑质TH+和海马CA1区ChAT+细胞的平均数。使用Imae-Pro-Plus软件计算纹状体区TH染色的MOD值(MOD=积分光密度值/总面积)。免疫组化染色后，黑质TH+和海马CA1区ChAT+细胞均呈棕色。

1.2.4Western-Blot检测海马区BDNF水平：第9天各组小鼠(每组n=10)用水合氯醛麻醉后，快速取出小鼠大脑组织，冰上解剖出海马组织，按150 mg小鼠脑组织加入500 μL的 RIPA裂解液比例置于RIPA裂解液缓冲液中，混合1%的PMSF冰上研磨，以12 000 r/min、离心半径为20 cm于4℃离心30 min，取上清，BCA法测蛋白质浓度。剩余样本加蛋白上样缓冲液，100℃变性5 min，将蛋白样品加入对应位置12%分离胶进行电泳。采用湿法将蛋白转移置甲醇活化的PVDF膜上后，5%脱脂奶粉PBST溶液室温封闭1 h，加入兔多克隆BDNF抗体(1∶1000)孵育，4℃过夜。次日清洗PVDF膜，进行羊抗兔IgG(1∶2000)室温下避光反应1 h，以β-actin(1∶2000)为内参进行二抗孵育。记录BDNF与β-actin灰度值比值，比较各组小鼠海马BDNF水平，并进行统计分析。

1.3 统计学处理数据均由SPSS 21.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，三组间比较的统计分析采用重复因素方差分析检验，组间两两比较，方差齐则采用LSD法，方差不齐采用SNK-q检验法。P<0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的表现PD组小鼠大多在第2次注射MPTP后出现震颤、竖尾、僵直、运动弛缓等行为，多在30 min内缓解，24 h内基本恢复，符合急性PD模型的表现。ESC组小鼠在ESC预处理3 d内未出现异常行为；在第3次注射MPTP后出现震颤、竖尾、僵直、运动弛缓等行为，多于20 min内缓解，符合急性PD模型的表现。对照组未出现任何异常行为。

2.2 各组小鼠认知功能和运动功能比较

2.2.1各组小鼠的学习能力比较：与PD组相比，ESC组和对照组小鼠寻台潜伏期均明显缩短(P<0.05)，ESC组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，具体见表1。

表1 各组小鼠寻台潜伏期比较(n=15，±s)

2.2.2各组小鼠记忆能力比较：与对照组小鼠相比，PD组穿过平台次数减少，穿越路程百分比缩短(P<0.05)；与PD组比较，ESC组穿过平台次数增多，穿越路程百分比升高(P<0.05)；ESC组与对照组比较，穿过平台次数和小鼠穿越路程百分比差异无统计学意义(P>0.05)，具体见表2。上述结果表明急性PD模型小鼠记忆能力受损，而ESC预处理对PD小鼠记忆能力受损可能有改善作用。

2.2.3各组小鼠的运动功能比较：与对照组比较，PD组速度减慢，爬杆时间延长(P<0.05)；与PD组比较，ESC组游泳速度增快，爬杆时间缩短(P<0.05)；ESC组与对照组比较游泳速度、爬杆时间差异无统计学意义(P>0.05)，具体见表2。上述结果表明ESC预处理可能改善PD模型小鼠的运动能力。

表2 各组小鼠水迷宫实验记忆能力和运动功能的比较(n=15，±s)

2.2.4各组小鼠TH+神经元和海马ChAT+细胞比较：对照组与ESC组小鼠黑质TH+细胞形态正常，神经元排列致密、整齐，胞核饱满，核仁清晰，无明显梭形改变，突起无明显减少；PD组黑质残留TH+细胞皱缩，胞核不饱满，核仁欠清晰，有梭形改变，突起减少。对照组海马CA1区的ChAT+细胞形态正常，PD组与ESC组ChAT+细胞形态与对照组无明显差异(图1)。与对照组比较，PD组及ESC组黑质TH+细胞数及纹状体TH+细胞的MOD值均显著降低(P<0.05)，但ESC组TH+细胞数及纹状体TH+细胞的MOD值明显高于PD组(P<0.05)。对照组与ESC组比PD组海马CA1区的ChAT+细胞数明显增多(P<0.05)，对照组与ESC组CA1区的ChAT+细胞数差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。上述结果表明，ESC预处理可减轻MPTP诱导急性PD模型小鼠黑质-纹状体多巴胺神经元的损害。

表3 各组小鼠的黑质TH+神经元、纹状体TH+神经纤维的MOD值及海马ChAT+神经元的比较(n=5，±s)

图1 各组小鼠黑质TH+细胞(×200)及海马CA1区ChAT+细胞数(×20)比较(LSAB免疫组化)

2.2.5各组小鼠海马区BDNF表达：通过 Western blot检测各组小鼠海马区BDNF含量，结果显示，PD组(0.09±0.01)BDNF含量明显低于对照组(0.64±0.27)，ESC组BDNF含量(0.57±0.05)明显高于PD组(均P<0.05)；而ESC组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，具体见图2。

注：BDNF：脑源性神经营养因子 图2 Western blot检测各组小鼠海马区BDNF的表达

3 讨论

目前认为PD是一种累及多系统的神经退行性疾病，伴有认知功能障碍、焦虑抑郁情绪等多种非运动症状，对患者生活质量的影响较大，甚至超过运动症状[8]。近年来研究显示，ESC作为高选择性5-羟色胺再摄取抑制剂 (selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)，对焦虑抑郁患者及一些动物模型的认知功能有改善作用[5]。ESC也可改善PD患者伴发的抑郁情绪和步态不稳[9]。目前尚不明确ESC对PD患者认知功能的影响。

既往研究发现急性缺血性脑卒中后抑郁患者应用SSRI类药物，能够显著改善运动功能、降低致残率、改善生活质量，并且在没有抑郁的卒中患者中仍然有效[10]。卒中前应用包含ESC在内的SSRI类药的脑卒中患者，运动功能评分显著高于卒中后抑郁再应用SSRI类药物的患者[11]。ESC改善运动功能的机制可能为促进脑卒中区域的神经恢复，改善脑血流分布，并发挥一定抗炎作用，且对肾上腺素能神经系统有所调节[12]。ESC也能够改善焦虑抑郁患者的运动表现[5]。本研究表明ESC可以改善由MPTP导致的PD小鼠运动能力的损害，对PD小鼠的多巴胺能神经元有一定的保护作用。但目前ESC对PD患者运动能力的影响及机制仍需深入研究。

有研究报道MPTP诱导的慢性PD小鼠模型可出现学习记忆能力下降[13-14]。本实验发现MPTP诱导的急性PD小鼠亦存在空间学习和记忆能力下降。腹侧被盖区及黑质多巴胺能神经元与记忆有关，且认知功能的下降与腹侧被盖区等区域的多巴胺含量的减少相关，表明多巴胺能够维持或提高认知功能[1]。ESC预处理也能增加Aβ1-42作用的海马细胞BDNF的释放，减缓神经细胞退行性变[1]。本实验发现急性PD模型海马CA1区的ChAT+细胞数减少并伴随BDNF水平下降可能与其认知功能下降也有一定的关系，而经ESC预处理的PD模型小鼠认知能力及海马区BDNF水平有明显提高，表明ESC可以改善PD小鼠的认知功能，且可能与海马区BDNF水平的提高相关。

提高神经可塑性是治疗认知功能障碍的基础之一。BDNF也是一种主要分布于神经系统、具有促进神经生长活性的蛋白质，在神经可塑性中扮演重要角色。研究表明，因BDNF含量的变化不但可以反映神经损伤的程度，而且BDNF也是起神经保护作用的重要因子之一[15]。在海马CA1-CA4区的锥体细胞层及齿状回的颗粒细胞层中BDNF含量丰富。BDNF缺乏而减弱的长时程增强，通过向海马区注入外源性BDNF而完全恢复，而注入抑制BDNF表达的反义寡核苷酸片段后，正常大鼠的学习记忆能力明显减弱[16]。ESC能够提高焦虑抑郁啮齿动物模型海马的BDNF水平[17]和脑缺血沙鼠模型海马CA1区的BDNF水平[15]。本研究中PD小鼠的BDNF水平伴随着认知功能的受损明显下降，而ESC组的PD小鼠海马区BDNF水平有明显提高。由此可以推测，ESC可能能够通过增加海马区BDNF水平，从而达到提高神经可塑性的目的。

综上所述，ESC可以改善PD小鼠的认知及运动功能，其机制可能与保护海马和黑质神经元，促进BDNF的分泌，提高神经可塑性有关。但关于ESC调控BDNF蛋白的表达和抵抗神经元损伤的确切机制还有待进一步的完善体外实验和在体研究。另外，ESC组海马和黑质细胞数量比PD组增多是由于新生细胞的增多还是通过对原有细胞的保护，亦有待进一步研究。