白芥子贴膏穴位贴敷对过敏性鼻炎大鼠的免疫调制作用研究

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的鼻黏膜慢性炎性疾病，临床表现主要以鼻塞、流涕、喷嚏为主，较重者可并发多种其他疾病，严重影响患者生活质量[1]。目前广泛使用的西药丙酸氟替卡松鼻腔喷雾剂只能短暂地缓解症状，远期效果不甚理想。多种研究显示，辅助性T细胞1（helper T cell 1，Th1）和辅助性T细胞2（helper T cell 2，Th2）的免疫失衡与AR的发生与发展过程密切相关[2-3]。穴位贴敷作为一种传统的中医外治疗法，可以通过调节Th1/Th2细胞平衡，从而改善机体免疫状态，临床及实验研究已证实其对AR的防治效果[4]。临床研究报道，生/炒白芥子贴膏穴位贴敷均可有效治疗呼吸道过敏性疾病，但两者的疗效差异存在争议[5-6]。故本研究通过建立AR大鼠模型，采用行为学评估大鼠AR严重程度，并用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和甲苯胺蓝染色法检测生/炒白芥子穴位贴敷对大鼠血清炎症因子水平和鼻黏膜中炎症细胞数量的影响，对比生/炒白芥子贴膏穴位贴敷治疗AR的疗效差异，并对其机制进行探讨。

1 材料和试剂

1.1 实验动物及分组 选取无特定病原体（specific pathogen free，SPF） 级健康雄性Wistar大鼠50只，6周龄，体质量250～300g，均由浙江中医药大学动物实验中心提供[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。所有大鼠分笼饲养于室温21～25℃、湿度60%～70%的环境中，自由饮水并以普通饲料饲养，12h昼夜交替，适应性喂养1周后进行实验。本研究方案通过浙江中医药大学动物伦理委员会批准，研究过程严格遵守《实验动物环境及设施:GB14925-2001》[7]，遵循伦理原则并保障动物福利。

1.2 主要试剂及仪器 生白芥子贴敷膏药（生白芥子、细辛、甘遂、延胡索）和炒白芥子贴敷膏药（炒白芥子、细辛、甘遂、延胡索）均由浙江中医药大学附属第一医院配制；丙酸氟替卡松鼻腔喷雾剂（每喷含丙酸氟替卡松50μg，浓度0.05%）购于Glaxo Smith Kline公司（批号：H20091100）；鸡卵白蛋白（ovalbumin，OVA）购于Sigma公司 （批号：A5503）； 白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素-γ （interferon-γ，IFN-γ）ELISA检测试剂盒均购于美国R&D公司（批号：24924、24956、24972、24475）。Eclipse 80i型光学显微镜购于日本 Nikon公司；RM 2235石蜡切片机为德国Leica公司产品。

1.3 方法

1.3.1 AR模型制备 将50只大鼠按照随机数字表法分为5组，对照组、模型组、西药组、生白芥子组和炒白芥子组，每组10只。除对照组外，其余各组大鼠分别从第1天开始腹腔注射新鲜配制的含OVA 0.3mg和Al（OH）330mg的0.9%氯化钠溶液1mL致敏，隔日1次，连续注射7次；第15天开始以0.9%氯化钠溶液配制的5%OVA溶液滴鼻，每侧50μg，并以1%OVA溶液雾化10min，连续滴鼻和雾化7d。对照组予以等量的0.9%氯化钠溶液滴鼻和雾化。

1.3.2 干预方法 造模后进行分组治疗，对照组正常饲养，不进行任何干预；模型组以0.9%氯化钠溶液滴鼻，每侧5μL，隔日1次，共治疗7次；生白芥子组和炒白芥子组大鼠背部剃毛，参考李忠仁[8]主编的《实验针灸学》，分别在其双侧肺俞、脾俞、肾俞处贴敷0.5cm×0.5cm的生白芥子和炒白芥子贴敷膏，以胶布固定，2h后取下，隔日1次，共治疗7次；西药组以丙酸氟替卡松鼻腔喷雾剂喷鼻，每侧5μL，隔日1次，共治疗7次。

1.3.3 检测指标

1.3.3.1 行为学表现 末次滴鼻雾化致敏后和治疗后即刻观察各组大鼠行为学表现及毛发光泽情况，共观察30min。将3个症状的分数相加即为总症状评分，总症状评分≥5分为造模成功[9]。见表1。

1.3.3.2 血清细胞因子检测 治疗结束24h内，各组大鼠以1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，心脏取血5mL，静置2h后3 000r/min离心10min，取血清置于-70℃冰箱保存。ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平，操作步骤严格遵循ELISA试剂盒说明书，并分析几个指标之间的相关性。

表1 AR症状评分表（分）Tab.1 Symptoms scale of AR（scores）

1.3.3.3 鼻黏膜病理观察 各组大鼠心脏取血后，以脱颈法处死，断头后剪去下颌，从鼻正中开裂鼻腔，分离含有鼻黏膜的鼻中隔，以4℃的0.9%氯化钠溶液进行漂洗，10%中性甲醛溶液固定24h，石蜡包埋并切片，每一标本随机选取5张切片行甲苯胺蓝染色，每张切片观察5个高倍视野，观察鼻黏膜组织肥大细胞形态并计数。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著差异（least significant difference，LSD）法；各组治疗前后比较采用配对t检验法。计量资料相关性采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后行为学表现比较 末次滴鼻雾化致敏后，各造模组大鼠总症状评分均较对照组显著增加（P＜0.05），且均大于5分，说明AR模型造模成功。各造模组治疗前组间比较，总症状评分差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。

除对照组外，其余各组大鼠治疗后症状评分均较治疗前显著下降（P＜0.05）。与对照组比较，模型组大鼠治疗后评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组治疗后评分均显著降低（P＜0.05）；与西药组比较，生白芥子组治疗后评分显著降低（P＜0.05），炒白芥子组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。说明西药和生/炒白芥子贴膏穴位贴敷疗法均能有效控制AR症状，且生白芥子组疗效更加显著。

2.2 各组大鼠血清细胞因子水平比较 与对照组比较，治疗后模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，IFN-γ水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，治疗后西药组、生白芥子组、炒白芥子组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低，IFN-γ水平显著升高（P＜0.05）。与西药组比较，治疗后生白芥子组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著下降，IFN-γ水平显著上升（P＜0.05）；炒白芥子组IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。提示西药和生/炒白芥子贴膏穴位贴敷疗法均能有效降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高IFN-γ水平，其中生白芥子组作用更显著。

表2 各组大鼠AR总症状评分比较（±s，分）Tab.2 Comparison of AR total symptom scores in each group（±s，scores）

表2 各组大鼠AR总症状评分比较（±s，分）Tab.2 Comparison of AR total symptom scores in each group（±s，scores）

注：与同组治疗前比较，△P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05Note:Compared with before treatment of the same group，△P＜0.05;compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with western medicine group，▲P＜0.05

治疗后对照组 2.00±0.89 1.50±0.50模型组 6.00±0.50* 5.13±0.60*△西药组 5.88±0.60* 3.75±0.43#△生白芥子组炒白芥子组组别治疗前6.00±1.00*6.00±0.87*2.63±0.48#△▲3.25±0.83#△

表3 各组大鼠血清细胞因子水平比较（±s，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels in each group（±s，pg·mL-1）

表3 各组大鼠血清细胞因子水平比较（±s，pg·mL-1）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels in each group（±s，pg·mL-1）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with western medicine group,▲P＜0.05

组别 IL-1β IL-6 TNF-α IFN-γ对照组 77.18±2.67 126.81±8.43 14.90±1.19 76.02±7.51模型组 125.01±7.99* 239.48±8.99* 28.44±5.00* 30.31±7.86*西药组 95.39±3.02# 206.00±5.83# 22.31±3.37# 55.14±5.65#生白芥子组 85.51±3.36#▲ 155.26±9.72#▲ 16.82±1.05#▲ 68.31±5.52#▲炒白芥子组 93.77±5.77# 201.70±8.67# 21.93±5.58# 56.44±5.82#

2.3 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平之间的相关性 Pearson相关性分析提示，大鼠血清IL-1β和IL-6、TNF-α的水平呈正相关（r=0.841、r=0.595，均P＜0.05），和IFN-γ的水平呈负相关（r=-0.818，P＜0.05）；IL-6和TNF-α的水平呈正相关（r=0.69，P＜0.05），和IFN-γ的水平呈负相关 （r=-0.861，P＜0.05）；TNF-α和IFN-γ的水平呈负相关（r=-0.68，P＜0.05）。见图1。

2.4 各组大鼠鼻黏膜肥大细胞计数比较 治疗后，模型组大鼠鼻黏膜肥大细胞计数较对照组明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、生白芥子组及炒白芥子组肥大细胞计数均明显降低（P＜0.05），与西药组比较，生白芥子组肥大细胞计数明显降低（P＜0.05），炒白芥子组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图2。

3 讨论

AR为世界范围内的主要慢性疾病之一，调查显示全球约20%～30%的人患有AR[10]，欧洲AR患病率为25%[11]，在美国约有3 590万人患有AR[12]，我国西部地区患病率34.41%，北方地区平均患病率9.3%，并呈逐年显著增加的趋势[13]。

图1 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ之间的相关性Fig.1 Correlation between rat serum IL-1β，IL-6，TNF-α and IFN-γ

表4 各组大鼠鼻黏膜肥大细胞计数比较（±s，个）Tab.4 Comparison of mast cell count in nasal mucosa in each group（±s，count）

表4 各组大鼠鼻黏膜肥大细胞计数比较（±s，个）Tab.4 Comparison of mast cell count in nasal mucosa in each group（±s，count）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with western medicine group，▲P＜0.05

肥大细胞计数对照组 1.2±0.4模型组 13.6±1.02*西药组 5.4±1.36#生白芥子组 2.6±0.49#▲炒白芥子组 5.8±0.75#组别

图2 各组大鼠鼻黏膜中肥大细胞浸润情况（甲苯胺蓝染色，400×）Fig 2 Mast cell infiltration in the nasal mucosa of rats in each group（Toluidine blue staining,400×）

AR在中医学中属于“鼻鼽”范畴，病因多为肺、脾、肾三脏功能失调，复感风寒邪气，寒邪束于皮毛，阳气无从泄越，故喷而上出为嚏所致，多为本虚标实之证，以肺、脾、肾三脏气虚阳衰为本，外感风寒之邪为标。清代医家张璐[14]所著的《张氏医通》中最早记载了用生白芥子、延胡索、细辛、甘遂和姜汁制成的贴膏穴位贴敷，用于治疗呼吸系统疾病。穴位贴敷的作用体现在对穴位的刺激和药物有效成分经皮吸收两方面，经络腧穴受到贴敷药物的刺激后血管紧张度下降，局部温度升高，促进血液循环，有利于中药成分的渗透和吸收；而局部贴敷能够使药物通过穴位局部皮肤细胞间隙直接吸收，两者共同作用，有助于增强疗效，并具有“简便廉验”的特点[15]。因肺气通于鼻，鼻居于面部中央，属土属脾，且脾为肺之母、肾为肺之根，故本研究选取肺俞、脾俞、肾俞三对穴位进行贴敷，有效防治AR。

研究表明，AR的发生是多种炎症细胞、介质共同参与并相互作用的结果，其发病机制主要是体质、环境等因素导致机体发生免疫紊乱，致使Th0细胞向Th2细胞分化增多，从而使Th1/Th2比例失衡，表现为嗜酸性粒细胞、肥大细胞增加，以及Th2细胞过度表达导致的炎症反应[2-3]。IL-1β和TNF-α作为促炎细胞因子，可刺激并激活嗜酸性粒细胞、肥大细胞等免疫活性细胞，释放炎性介质[16-17]。IL-6作为Th2细胞分泌的促炎细胞因子，可诱导T淋巴细胞增殖和活化，促进炎症细胞因子释放；同时它作为次级因子，可由TNF-α产生，并反馈性增强TNF-α的致炎作用[18-20]。这些因子相互作用、互相促进，破坏了Th1/Th2的平衡，从而造成机体持续的炎性损伤[21]。而IFN-γ作为Th1细胞分泌的主要因子，具有抗病毒活性及较强的免疫调节功能，能缓解IL-1β、IL-6、TNF-α造成的Th1/Th2的失衡，从而抑制AR的进程[22]。本研究显示，生/炒白芥子贴膏穴位贴敷治疗后大鼠喷嚏、流涕、抓鼻等AR行为学表现均较治疗前减少，明确了穴位贴敷治疗AR的有效性，其中的机制可能与降低AR大鼠血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高抗炎细胞因子IFN-γ水平，并降低鼻黏膜中肥大细胞数量有关。

对于生/炒白芥子贴膏对于呼吸道过敏性疾病的疗效是否有差异，临床上尚存在一定的争议。有研究发现，单纯生白芥子组方贴膏对于肺气虚寒型AR的临床疗效优于单纯炒白芥子组方贴膏[23]，单纯生白芥子组方贴膏组支气管哮喘患者远期疗效优于生炒各半并用组方贴膏组及单纯炒白芥子组方贴膏组[24]。生/炒白芥子不同配比的贴膏疗效也有差异，生/炒白芥子1∶2配比的三伏灸协定方较生/炒白芥子1∶1配比的协定方及单纯炒白芥子的协定方更能改善支气管哮喘患者相关症状，并且患者皮肤反应较轻，依从性更好[25]。也有研究显示，由生白芥子贴膏、生/炒各半贴膏和炒白芥子贴膏治疗支气管哮喘的疗效差异无统计学意义[5，26]。本研究选取生/炒白芥子贴膏贴敷于AR大鼠背部相关穴位，比较两组的疗效，并试图从免疫学角度解释相关机制，结果显示生白芥子组大鼠鼻部炎性症状改善优于炒白芥子组、鼻黏膜病理切片中炎性改变显著减轻，而且血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低，IFN-γ水平显著升高。

综上所述，生/炒白芥子贴膏穴位贴敷疗法均能有效治疗AR，而生白芥子贴膏疗效更为显著，其机制可能是生白芥子贴膏能够更明显地减轻大鼠鼻黏膜局部炎症，抑制全身促炎细胞因子的释放。本研究结果进一步探索了穴位贴敷疗法防治AR的机制，同时也为中医药防治AR提供了实验依据。