香草扶正合剂对Lewis肺癌模型小鼠癌细胞自噬的影响

王硕 廖文宇 程权 丁志山 傅华洲

1.浙江中医药大学第四临床医学院 杭州 310053 2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院3.浙江中医药大学医学技术学院

肺癌是全球癌症相关死亡最主要的原因，严重危害人类健康[1]。目前，临床上治疗肺癌的方法有手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗等，但各种疗法均有其不足之处，手术是早中期肿瘤患者的首选治疗方案，然而部分患者确诊时已为晚期，丧失手术机会，手术难有获益；化疗、放疗是传统的肿瘤治疗方案，但其副作用较强，体质较差的患者难以耐受；靶向治疗有较好的疗效，但有选择性，且易发生耐药；免疫治疗是未来肿瘤治疗的趋势，但可选择药物较少，且许多药物的副作用不容忽视。随着现代医学的不断进步及对中医药的深入研究，中医药在肿瘤治疗中的作用及重要性越来越明显。以中医药为主的多学科综合治疗，为肺癌的治疗开辟了新的路径。临床上，中医药治疗是安全有效的肺癌治疗方法之一，其在治疗肺癌方面的优势在于增加带瘤生存时间，提高患者生存质量，还可以作为放、化疗的辅助治疗，起到增效减毒、减轻患者不良反应、提高患者对放化疗的耐受性等作用[2]。研究证实，包括人参皂苷在内的多种中药有效成分能调控肿瘤细胞自噬，抑制肿瘤的发生和发展[3]。香草扶正合剂（Xiangcao Fuzheng Mixture，XCFZ）为浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院院内协定方，自2016年起用于肺癌的治疗和辅助治疗，并作为浙江省中医药防治重大疾病攻关计划项目开展临床研究。XCFZ是由人参、细梗香草等多种具有扶正抗癌功效的中药组成的复方制剂，含多种有效成分，笔者推测其抗肿瘤机制可能与自噬相关，因此本研究拟探讨XCFZ的抗肿瘤作用及其对癌细胞自噬的影响，为临床运用并推广XCFZ提供基础研究依据。

1 材料和仪器

1.1 实验动物 健康雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级C57BL/6小鼠60只，6周龄，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。所有小鼠均在SPF级环境下隔离饲养。

1.2 细胞 C57BL/6荷瘤小鼠肿瘤组织制取的Lewis肺癌单细胞悬液，由浙江中医药大学医学技术学院实验室提供。

1.3 药物和试剂 XCFZ具体组成：细梗香草15g，人参10g，猪苓10g，茯苓30g，麸炒白术12g，薏苡仁30g，防风10g，石斛12g，蝉蜕6g，甘草8g。细梗香草又名满山香（Lysimachia capillipes Hemsl.），产自龙岩市新罗区（批号：20180710）；人参、茯苓、麸炒白术、薏苡仁、防风、石斛购于杭州华东中药饮片有限公司（批号：190705、190622、190622、190918、19091009、190809）；蝉蜕、猪苓购于上药凯伦医药股份有限公司 （批号：190303、190303）；甘草购于浙江佐力百草中药饮片有限公司（批号：20190201）。以上中药饮片全部由杭州市第一人民医院中药房提供，并经浙江大学田景奎教授鉴定为正品。中药饮片由杭州市第一人民医院中药房代煎，抽滤后旋蒸浓缩。根据等效剂量系数折算法计算药品稀释浓度，得到XCFZ终浓度为：低剂量0.93g·mL-1，中剂量1.86g·mL-1（相当于临床用药剂量），高剂量3.72g·mL-1。顺铂注射液购于江苏豪森药业集团有限公司（批号：81209），稀释至0.64mg·mL-1。自噬相关基因Beclin1、自噬相关蛋白5（autophagy related 5，Atg5）、微管相关蛋白1轻链3-β（microtubule associated protein 1 light chain3-β，LC3b）一抗均购于日本MBL公司（批号：006、004、015）；β-actin一抗、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购于美国Immunoway公司（批号：B2801、B0201、B0201）；BeyoRTTMⅡ cDNA合成试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司（批号：12018190503）；Power UpSYBR Green Master Mix购于美国ABI公司（批号：00787264）。

1.4 主要仪器 聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳槽、电泳转印仪均为美国Bio-Rad公司产品；Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统购于上海天能科技有限公司；2720 Thermal Cycler PCR仪购于美国赛默飞公司；7500 Real-Time PCR System购于美国ABI公司；H-7650型透射电子显微镜为日本HITACHI公司产品。

1.5 方法

1.5.1 动物造模、分组及给药 小鼠适应性饲养7d后随机抽取8只作为空白组，剩余小鼠共同造模，造模方法参考文献[4]。从造模成功的小鼠中选取40只状态良好的荷瘤小鼠，随机分为5组，每组8只，分别为模型组、XCFZ低剂量组、XCFZ中剂量组、XCFZ高剂量组、顺铂组即阳性对照组。造模成功后开始给药。模型组以双蒸水0.2mL·d-1灌胃；XCFZ低、中、高剂量组分别以XCFZ低、中、高剂量0.2mL·d-1灌胃；顺铂组以顺铂溶液0.1mL·（2d）-1腹腔注射，同时以双蒸水0.2mL·d-1灌胃。各组小鼠每天固定时间给药，给药14d。停药24h后称重，脱颈处死小鼠，完整剥离瘤体，迅速取1mm3体积瘤体标本浸入pH=7.4的2.5%戊二醛中；记录小鼠瘤质量和去瘤后体质量并计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/模型组平均瘤体积）×100%。部分瘤体于-80℃冻存，其余部分固定于4%多聚甲醛中。

1.5.2 肿瘤组织病理形态学观察 取出固定的肿瘤组织，冲洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm切片，脱蜡后苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，封片，光镜下观察肿瘤组织形态学改变。

1.5.3 透射电镜观察瘤组织自噬小体 取出固定完成的瘤体标本，磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸固定，乙醇、丙酮逐级脱水，Epon812包埋过夜，70nm超薄切片，铀、铅双重染色，电镜下观察肿瘤组织细胞的自噬小体。

1.5.4 Western blot检测肿瘤组织Beclin1、Atg5、LC3b蛋白表达 提取肿瘤组织总蛋白，二喹啉甲酸法测蛋白浓度，加入上样缓冲液后变性，制胶，电泳，转膜，先后加入一抗、二抗孵育，洗膜后电化学发光显影，Adobe Photoshop CS6软件分析条带灰度值。

1.5.5 实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技术检测肿瘤组织相关蛋白mRNA表达水平 Trizol法提取肿瘤组织总RNA，空白组取肺组织，检测RNA浓度及纯度后，使用BeyoRTTMⅡ cDNA合成试剂盒进行逆转录，按Power Up SYBR Green Master Mix说明书，使用7500 Real Time PCR System进行扩增，分别检测Beclin1、Atg5、LC3b、Unc-51样自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）mRNA表达水平。所有引物都由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。用Relative Quantification Study法分析，以2-△△Ct计算mRNA相对表达量。

1.6 统计学分析 采用在线SPSS分析软件（https://spssau.com/front/spssau/index.html）进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 结果

2.1 各组小鼠瘤质量、抑瘤率和去瘤后体质量比较 与模型组比较，各给药组瘤质量降低（P＜0.01），顺铂组抑瘤率最高，其次为XCFZ中剂量组。与模型组比较，XCFZ中剂量组去瘤后体质量升高（P＜0.05），顺铂组降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，XCFZ低、中、高剂量组去瘤后体质量升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

2.2 各组小鼠肿瘤组织形态学观察 光镜下模型组肿瘤细胞排列紧密、紊乱，核染色深，核分裂现象多见，异型性明显，肿瘤细胞坏死、核仁固缩少见；XCFZ各剂基组核分裂现象和异型细胞较少，多见肿瘤细胞核仁固缩现象，多见细胞间空洞和孤立细胞，细胞坏死和核碎裂现象亦较多。顺铂组核分裂现象和异型细胞少见，可见瘤细胞较小，大片坏死细胞和碎裂的细胞核，核仁固缩和细胞间空洞亦多见。见图1。

2.3 各组小鼠肿瘤组织细胞超微结构比较 各组均可观察到双层或多层膜包裹的自噬小体，自噬小体内可见核的碎片和细胞器。模型组自噬体少见，且细胞结构较为完整。XCFZ各剂量组可见大片自噬体，细胞结构破坏严重，细胞质明显减少，胞内可见大量空泡。顺铂组细胞结构破坏最为严重，自噬体较多，且自噬体内容物降解严重。见图2。

表2 各组小鼠瘤质量、抑瘤率和去瘤后体质量的影响（±s，n=8）Tab.2 Comparison of tumor quality，tumor inhibition rate and weight after tumor removal in each group （±s，n=8）

表2 各组小鼠瘤质量、抑瘤率和去瘤后体质量的影响（±s，n=8）Tab.2 Comparison of tumor quality，tumor inhibition rate and weight after tumor removal in each group （±s，n=8）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with model group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with cisplatin group，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 瘤质量（g） 抑瘤率（%） 去瘤后体质量（g）模型组 1.64±0.26 0 19.35±1.81 XCFZ 低剂量组 1.03±0.28** 39.22 19.64±0.91△XCFZ 中剂量组 0.73±0.31** 57.08 21.25±1.39*△△XCFZ 高剂量组 1.03±0.13** 39.17 19.77±0.95△顺铂组 0.64±0.29** 62.55 17.32±1.77*

图1 各组小鼠肿瘤组织病理学观察（HE染色，400×）Fig.1 Histopathological observation of tumor in each group（HE staining，400×）

2.4 各组小鼠肿瘤组织自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3b表达比较 与模型组比较，XCFZ低、中剂量组和顺铂组Beclin1表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ高剂量组Beclin1表达降低（P＜0.01）。与模型组比较，XCFZ中、高剂量组和顺铂组Atg5表达升高（P＜0.01）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低、高剂量组Atg5表达降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组Atg5表达升高（P＜0.05）。与模型组比较，XCFZ低、中、高剂量组和顺铂组LC3b表达升高（P＜0.01）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低、高剂量组LC3b表达降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组LC3b表达升高（P＜0.01）。见图3。

图2 各组小鼠肿瘤组织细胞超微结构观察（15 000×）Fig.2 Ultrastructural observation of tumor cells in each group（15 000×）

图3 各组小鼠肿瘤组织Beclin1、Atg5、LC3表达水平比较Fig.3 Comparison of expression level of Atg5，Beclin1 and LC3 in each group

2.5 各组小鼠肿瘤组织相关蛋白mRNA表达比较 与模型组比较，XCFZ低、中、高剂量组和顺铂组Beclin1 mRNA表达升高 （P＜0.01）； 与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低、高剂量组Beclin1 mRNA表达降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组Beclin1 mRNA表达升高（P＜0.05）。与模型组比较，XCFZ中、高剂量组和顺铂组Atg5 mRNA表达升高（P＜0.01）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低、高剂量组Atg5 mRNA表达降低（P＜0.01）； 与顺铂组比较，XCFZ中剂量组Atg5 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，XCFZ低、中、高剂量组和顺铂组LC3b mRNA表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低剂量组LC3b mRNA表达降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组LC3b mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，XCFZ低、中、高剂量组和顺铂组Bax/Bcl-2升高 （P＜0.01）； 与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低、高剂量组Bax/Bcl-2降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组Bax/Bcl-2差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，XCFZ低、中、高剂量组和顺铂组ULK1 mRNA表达升高（P＜0.05）；与XCFZ中剂量组比较，XCFZ低剂量组ULK1 mRNA表达降低（P＜0.01）；与顺铂组比较，XCFZ中剂量组ULK1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组小鼠肿瘤组织Beclin1、Atg5、LC3b、ULK1 mRNA表达和Bax/Bcl-2比较Fig.4 Comparison of the expressions of Beclin1，Atg5，LC3b，ULK1 mRNA and Bax/Bcl-2 in each group

3 讨论

XCFZ由扶正康复液（又名人参二苓汤）加味细梗香草而成。扶正康复液为浙江省名中医傅华洲教授的经验方，作为浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院院内协定方，自2012年起广泛用于大病及手术后康复、肿瘤放化疗的辅助治疗，临床疗效明显，并已经有较多的临床研究和基础研究报道[5-6]。2016年，傅华洲教授根据细梗香草体外抗肿瘤研究结果[7]和民间使用经验，在扶正康复液基础上加味细梗香草，组成XCFZ并作为肺癌治疗和辅助治疗的专用方，目前已立项为浙江省中医药防治重大疾病攻关计划，准备进一步深入研究。

《内经》云：“邪之所凑，其气必虚。壮人无积，虚人则有之。脾胃虚弱，气血两虚，四时有感，皆能成积。”肿瘤虽多虚实夹杂，但其本质是虚证；且此类患者多脾胃虚弱，阳气不足，气机不畅，多有痰饮水湿等病理产物，故痰湿交阻而成癥积，宜用平补、调补之法辅以消法。XCFZ以兼具扶正抗癌功效的细梗香草为君，人参、茯苓、薏苡仁、白术共为臣药，均有益气健脾之功效，且人参可大补元气，茯苓利水渗湿，白术利水燥湿，薏苡仁利水渗湿又可解毒散结，符合肿瘤患者久病体虚、正气不足且多痰湿的病机特点。猪苓味甘淡，性平，能渗泄水湿，可辅助人参、茯苓、薏苡仁、白术4味，增强祛湿化痰之功效；蝉蜕疏散风热、宣散透发，又可利水以攻邪；石斛益胃生津、清热滋阴而不滋腻，能防止方中参、术之温性太过，反致化热助邪；体虚者多表虚不固，易感六淫之邪，故以防风祛风固表以防外邪；甘草补益脾胃、调和诸药，为佐药。诸药合用，符合肿瘤患者肺脾两虚、癌毒滞结的基本病机特点，故能随证取效。

本研究通过建立Lewis肺癌移植瘤模型，结果提示XCFZ抑瘤作用明显，而且中剂量组在各剂量组中效果最佳。本研究中XCFZ的稀释浓度是根据等效剂量系数折算法计算的，XCFZ中剂量相当于临床用药剂量，高剂量和低剂量浓度分别为中剂量的2倍和0.5倍。XCFZ临床用药剂量为傅华洲教授根据前人经验、中药性质和多年门诊经验调整而来，其剂量较为符合肺肿瘤患者的病情。低剂量XCFZ的抑瘤效果降低，可能是中药剂量依赖性的体现；高剂量XCFZ的抑瘤效果降低，可能与药物代谢产物的毒性作用相关，有待进一步研究。本研究中XCFZ中剂量在各剂量组中效果最佳，提示中剂量可能更有利于药效的发挥，亦可为目前临床用药剂量提供依据。与顺铂组和模型组比较，XCFZ中剂量组可升高小鼠去瘤后体质量，提示XCFZ中剂量可能对荷瘤小鼠机体具有保护作用。

自噬是真核细胞程序性死亡的一种方式。研究认为，自噬活性降低可能与人类癌症的发生有关[8]，而诱导肿瘤自噬可起到抑瘤效果[9]。ULK1是DNA结合转录调节子调控的转录共激活因子的负调节大分子复合物之一，活化ULK1是自噬的重要启动步骤[10]。自噬体延伸需要两个泛素样结合体系，即Atg5-Atg12结合体系和LC3结合体系，Atg5可能是Atg12偶联的唯一目标[11]；而LC3是酵母Atg8的自噬体直向同源物，在自噬溶酶体的形成中起着至关重要的作用，目前已被公认为自噬标志物。LC3一般以可溶性LC3Ⅰ的形式存在，当自噬发生时，LC3和自噬小体表面的磷脂酰乙醇胺结合，转变为脂溶性的LC3Ⅱ，而LC3Ⅱ的表达与自噬活性呈正比[12]。Beclin1与酵母Atg6基因同源，参与自噬小体形成，在自噬中发挥核心作用，其过表达可诱导自噬，并在抑制肿瘤方面起着重要作用[13]。本研究结果表明，XCFZ中剂量可升高Atg5、Beclin1、LC3Ⅱ的蛋白表达 水 平和Atg5、Beclin1、LC3b、ULK1的mRNA表达水平，提示XCFZ可能通过诱导细胞自噬，从而抑制肿瘤生长。

诱导癌细胞凋亡也是抑制肿瘤生长的重要方式。Beclin1-Bcl-2是自噬与凋亡间第一个确定的分子连接，Beclin1是一种促凋亡蛋白，其表达水平升高可引起Bax与Bcl-2解聚，进而促进凋亡[13-14]。Atg5过表达可增加肿瘤细胞对各种凋亡诱导因素的敏感性[15]。XCFZ可升高Beclin1、Atg5蛋白及mRNA表达水平，并使Bax/Bcl-2 mRNA的比值升高，提示XCFZ的抑瘤机制还可能与自噬相关凋亡有关，可能通过刺激Beclin1蛋白表达，导致Bax与Bcl-2的解聚，从而诱导癌细胞凋亡；并通过促进Atg5的表达，增加肿瘤细胞对凋亡的敏感性。

综上所述，本研究中XCFZ和顺铂对自噬相关蛋白及mRNA表达水平的影响具有相同趋势，表明两者的抑瘤机制存在相似之处。但对小鼠肿瘤细胞超微结构的观察显示，XCFZ可明显减少瘤细胞胞质，提示其抑瘤机制可能与顺铂不同，有待进一步研究。