超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中结晶紫残留干扰因素分析

刘国红，张惠南，张敏，刘娟，李淑静，*

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300461；2.天津天狮学院，天津301700）

结晶紫，以N，N-二甲基苯胺为原料，经过加工得到成品，是一种三苯基甲烷染料[1]。结晶紫用途广泛，多用于消毒、杀菌、生物染色剂、兽药、饲料等。结晶紫以其杀菌效果好，保鲜效果佳的特点，多年来广泛用于水产养殖业和水产品长途运输。然而，研究发现结晶紫易被生物组织吸收，在生物体内代谢后生成具有致癌、致畸、高毒、高残留特性的隐性结晶紫[2-4]。目前很多国家地区都将结晶紫列为水产养殖的禁用药物，我国目前也将结晶紫列为可食用动物禁用兽药。

近年来，可食用动物中违规使用结晶紫等药品的情况备受关注。欧盟要求水产品中结晶紫不得检出。2005年，我国发布实施的GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[5]规定结晶紫的检测限为 2.0 μg/kg。

然而，检测过程中时常遇到试剂空白检出结晶紫，以及分析结果稳定性差的现象。国内有学者对结晶紫检测做了相关研究。吴淑秀等[6]应用高效液相色谱串联质谱法测定了实验室检测过程中常用的笔、纸、标签、样品袋等用品中结晶紫的含量。结果表明，大部分供试物品均含有一定量的结晶紫，其中A4打印纸、标签纸和圆珠笔中含量很高。高华鹏等[7]采用超高效液相串联质谱法测定了结晶紫和隐性结晶紫的含量，结果显示出实验室用品均能检出结晶紫。许荣富等[8]用反相柱成功地分离出了结晶紫、甲基紫、碱性品蓝、碱性艳蓝B、铜酞菁和罗丹明B等几种有色染料成分，检测出圆珠笔的结晶紫含量。

本文针对水产品检测过程中结晶紫检测干扰因素进行分析，在不同的时间条件下，对试验可能接触的办公用品如纸、笔、标签纸，以及包装材料如留样用塑料袋中的结晶紫含量进行检测，从而得出随时间变化的干扰因素对检测结果的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

A4打印纸、送样样品标签纸、激光打印标签纸、黑色签字笔、黑色马克笔、蓝色圆珠笔：得力集团有限公司；实验室滤纸：塘玻（天津）实验仪器销售有限公司；留样用塑料袋：河源市华丰塑胶有限公司。

乙腈（色谱纯）：德国默克公司；乙酸铵（优级纯）：天津科密欧化学试剂公司；结晶紫、隐性结晶紫：德国Dr.Ehrensorfer公司。

1290/6460超 高效液质联用仪、Eclipse Plus色谱柱C18（5μm×100mm×2.1mm）：德国 Agilent公司；AL204-IC电子天平：上海梅特勒-托利多仪器；WAT200609固相萃取装置：沃特世Waters公司；HS501振荡器：IKA公司；1 mL/cc一次性使用无菌注射器：浙江华福医用器材有限公司；尼龙膜过滤器（0.22 μm，13 mm）：博纳艾杰尔科技有限公司；1 mL进样瓶：浙江爱吉仁科技有限公司；2 mL塑料滴管：上海晶安生物信息有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

0.1 μg/mL的结晶紫工作液的配制：精确移取0.01 mL 0.1 mg/mL的结晶紫中间液，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线于4℃以下避光储存摇匀备用。

1.2.2 样品前处理

将待测的A4纸、实验室滤纸、送样样品标签纸、激光打印标签纸和留样用塑料袋分别裁剪成2 cm×2 cm同样大小的纸片，如图1所示。把待测所用黑色签字笔、黑色马克笔、蓝色圆珠笔分别在2 cm×2 cm的空白实验室滤纸上用力均匀[9]地分别书写一条、两条、四条长度为两厘米的印记并晾干，如图2所示。加入2 mL乙腈浸提5 min，涡旋振荡5 min。浸提液经0.22 μm滤膜过滤。

图1 纸样品前处理Fig.1 Pre-processing of paper sample

图2 笔样品前处理Fig.2 Pre-processing of pen sample

1.2.3 不同提取时间对污染物含量影响

将裁剪好的相同滤纸中画相同两条黑色签字笔印记的纸、画有相同黑色马克笔印记的滤纸、画有相同蓝色圆珠笔印记的滤纸、相同送样样品标签纸、相同激光打印标签纸、相同留样用塑料袋分别放入50 mL离心管中，加入2 mL乙腈分别浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min，浸提液经 0.22 μm滤膜过滤后用高效液相色谱-质谱联用仪检测污染物（显性结晶紫和隐性结晶紫）含量。重复5次作为平行试验，从而减小误差。

1.2.4 仪器条件

1.2.4.1 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18，1.8 μm×100 mm×2.1 mm（内径）；流动相：A为500 mL乙腈+500 μL甲酸+0.385 g乙酸铵，B 为乙腈；流速：300 μL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Gradient condition of mobile phase

1.2.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（multiplereactionmonitoring，MRM）；电喷雾电压：4 000 V；壳气温度：350℃；离子源温度：300℃。

显性结晶紫和隐性结晶紫检测的质谱条件见表2。

表2 显性结晶紫和隐性结晶紫的质谱条件Table 2 Mass spectrometer conditions for gentian violet and leuco gentian violet

1.2.5 标准曲线的绘制

准确分别吸取结晶紫的标准工作液0、1、5、10、20、50、100 μL 至进样瓶内，依次分别加入乙腈 1 000、999、995、990、980、950、900 μL 至每个进样瓶内，配制成浓度为 0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的结晶紫标准液。将不同浓度的标准液置于超高效液相色谱串联质谱仪，在最佳色谱条件下进行色谱分析，以保留时间定性，测定峰面积定量。以结晶紫及其代谢物浓度为横坐标，以结晶紫及其代谢物的液相峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及其相关系数。

2 结果与分析

2.1 显性结晶紫和隐性结晶紫的检出限

图3和图4分别为0.05 μg/L显性结晶紫和隐性结晶紫的选择离子色谱图。

图3 0.05 μg/L显性结晶紫选择离子色谱图Fig.3 MRM chromatography for 0.05 μg/L gentian violet

图4 0.05 μg/L隐性结晶紫选择离子色谱图Fig.4 MRM chromatography for 0.05 μg/L leuco gentian violet

在0.5 μg/L浓度下，显性结晶紫的信噪比S/N=17.5，隐性结晶紫的信噪比S/N=71.9，均大于3，按照GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》规定，S/N＞3可以定义为检出限。因此本方法中显性结晶紫、隐性结晶紫的检出限定为0.5 μg/L。由图3和图4可得，该试验条件测得的显性结晶紫的保留时间为5.81 min，隐性结晶紫的保留时间为7.52 min。

2.2 标准曲线

按照1.2.5的方法制作标准曲线，以结晶紫的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结晶紫标准品的标准曲线为Y=150 049.37X+12 345.95，相关系数 R2＝0.995 7，线性范围为 0～5 μg/L，线性关系良好。

以隐性结晶紫的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，隐性结晶紫标准品的标准曲线为Y=56 370.42X-2 861.45，相关系数 R2＝0.999 5，线性范围为 0～5 μg/L，线性关系良好。

2.3 结晶紫随时间变化的含量分析

6种待分析样品结晶紫残留含量结果见表3。

表3 结晶紫随时间变化的含量分析Tab.3 Analysis on the content of gentian violet changed over time

由表3可得出在对6种待分析样品分别浸提5、10、30、60、120、240、360 min 和 720 min 后检测结晶紫含量，黑色签字笔划线纸没有检出显性结晶紫和隐性结晶紫含量，黑色马克笔划线纸和留样用塑料袋中没有检出隐性结晶紫含量。在5 min～720 min内黑色马克笔划线纸中的显性结晶紫含量随时间的延长而增加。在720 min时达到顶峰，其浓度为0.30 μg/L。其原因可能是由于随时间的增加马克笔油墨中的染料含有的污染物不断析出[10]。在5 min～720 min内蓝色圆珠笔划线纸中显性结晶紫含量非常高且随时间的加长而增加，在720 min时达到顶峰，其浓度为392.96 μg/L。其隐性结晶紫含量也随时间的延长而增加。蓝色圆珠笔划线纸中含有的显性结晶紫和隐性结晶紫含量非常高，原因可能是由于圆珠笔油墨中的染料含有结晶紫所以对试验造成了极大的污染，并且随时间增加污染物在不断的析出[9]。送样样品标签纸中显性结晶紫随时间的延长而增加，其浓度在720 min时达到顶峰浓度为51.30 μg/L。其隐性结晶紫含量也随时间的加长而增加。其原因可能是由于实验室标签纸在生产运输时受到结晶紫的污染。激光打印标签纸中显性结晶紫随时间的加长而增加，其隐性结晶紫含量也基本随时间的加长而增加，其原因可能是由于激光打印的墨汁中含有结晶紫。留样用塑料袋中显性结晶紫含量整体随时间的加长而增加。存在显性结晶紫的原因可能是由于在塑料袋的保存和运输过程中受到含有结晶紫物质的污染。

3 结论与讨论

本文研究超高效液相色谱串联质谱法检测水产品测定过程中可能存在的干扰因素，包括水产品的样品采集、流通，以及实验室检测过程中可能被污染的包装材料样本中结晶紫含量随时间变化的情况。除了黑色签字笔划线纸没有测定出显性及隐性结晶紫以外，在黑色马克笔划线纸、蓝色圆珠笔划线纸、送样样品标签纸、激光打印标签纸、留样用塑料袋中显性结晶紫的含量变化趋势一致，都随时间的延长有增长趋势。蓝色圆珠笔划线纸中的隐性结晶紫含量也很高，5 min～720 min时隐性结晶紫从8.18 μg/L升高到15.90 μg/L，随时间延长含量出现了增长。送样样品标签纸、激光打印标签纸中隐性结晶紫含量也有了不同程度的检出，同样随时间延长出现了增长。黑色马克笔划线纸、留样用塑料袋中没有检出隐性结晶紫。

综上所述，结晶紫（含显性结晶紫和隐性结晶紫）检测结果在样品采集、传递及实验室检测过程中会受包装材料的影响，原因是马克笔、圆珠笔，激光打印的墨粉中的结晶紫染料可能析出，染料中析出的结晶紫检出值随时间延长而升高。该研究为探索水产品中结晶紫检测受包装材料的影响情况提供了依据，为结晶紫检测假阳性研究提供了参考。