不同提取方法对甜荞蛋白理化特性的影响

万晨茜，白文明，高立城，孙领航，冯佰利，高金锋

（西北农林科技大学农学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100）

甜荞（Fagopyrum esculentum Moench）又名普通荞麦，属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill），英文名common buckwheat。荞麦属于小宗杂粮作物，原产于中国，在世界上广泛种植[1-2]。甜荞在我国大多分布于北方，主要栽种于东北、华北、西北和西南云贵川一带的高寒丘陵地区，具有生长期短、耐寒性较强的特点[3-4]。甜荞是荞麦的两个栽培种之一，是一种药食同源作物，在营养、药用和食品方面具有很高的价值[5]。随着人们生活水平逐渐提高，越来越多的人开始关注食疗及全谷物摄取，甜荞作为一种药食兼用作物正日益受到人们的青睐。蛋白质是甜荞的重要营养组分，约占甜荞籽粒含量的15%左右，高于普通禾谷类作物，且具有良好的氨基酸平衡模式和很高的生物学价值[6]。Han等对荞麦、小麦等9种谷物的蛋白质质量和从这些谷物中获得成人可消化必需氨基酸进行了评分，发现荞麦评分最高，被认为是谷物中最好的蛋白质来源[7]。在生产与研究中，不同方法提取的蛋白质其纯度和理化特性有所不同，而理化特性又决定了蛋白质制品的功能和加工特性[8]。目前，蛋白质提取方法主要有碱溶酸沉法、酶法、盐浸法、超声波辅助提取法等。水稻、大麦、小麦、鹰嘴豆、豌豆、扁豆等蛋白质的提取常采用碱溶酸沉法[9-12]；葡萄籽、花生、油菜籽、芋艿蛋白质则采用酶法[13-17]；蚕豆蛋白质的提取则常采用盐浸法[18]；大豆、小麦胚芽、碎米则采用超声波辅助提取法，提高脱脂大豆分离蛋白的回收率，同时改变某些功能特性[19-21]。

目前，关于甜荞蛋白质提取方法的研究虽有报道，但未进行不同提取方法之间的比较。本研究按照前人已优化的蛋白质提取工艺，并加以改进，应用碱溶酸沉法、酶法、盐浸法3种方法提取甜荞籽粒蛋白质，比较研究不同提取方法对甜荞粗蛋白以及蛋白各组分含量、蛋白颗粒形态、溶解性、泡沫特性、乳化特性、持水性、持油性、热变性等理化特性的影响，以期获得适宜各类食品加工的甜荞蛋白质提取方法，旨在为甜荞蛋白质提取工艺及食品加工利用提供技术参考。

1 材料与仪器

1.1 试验材料与试剂

试验材料所用甜荞品种为西农9976，由西北农林科技大学小宗粮豆课题组提供，为2017年收获籽粒。选取大小均匀一致，籽粒饱满，色泽正常的籽粒500 g，用于蛋白质提取。

石油醚、乙醇：成都市科隆化学品有限公司；盐酸：洛阳昊华化学试剂有限公司；碱性蛋白酶（酶活2.0×105U/g）、酪蛋白：北京索莱宝科技有限公司；蔗糖（食品级）、氯化钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、五水合硫酸铜、酒石酸钾钠：广东光华科技股份有限公司；以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Blue Star B分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；SF-TDL-5A低速台式大容量离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；FW-100D高速万能粉碎机：天津鑫博得仪器有限公司；S-4800型场发射扫描电子显微镜：日本日立公司；Q2000型差示扫描量热仪；DGX-9243B电热鼓风干燥箱：上海琅玕试验设备有限公司；XHF-D高速分散器（内切式匀浆机）：宁波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 甜荞蛋白质提取方法

2.1.1 碱溶酸沉法

参考并改进陶健等[22]的方法，精选甜荞籽粒500 g进行脱壳处理并浸泡在石油醚中30 min，得到脱脂荞麦，将其放入40℃左右的烘箱中烘干至无石油醚味。用高速万能粉碎机磨粉，并放入105℃烘箱中2 h，蒸干水分以及物料结晶水。过100目筛，得到荞麦全粉。将全粉按液料比15∶1（mL/g）添加蒸馏水，50℃水浴一定时间，保鲜膜封口防止水分蒸发。待烧杯内温度达到试验设计的温度时，缓慢加入0.5 mol/L NaOH溶液，调pH值至8.0，搅拌提取30 min，期间保持pH值恒定。将物料和浸提液转移入离心管中，4 000 r/min离心10 min，去掉离心管底部淀粉沉淀物，上清液用0.5 mol/L HCl调节pH值至3.8（等电点），生成絮状沉淀，即为固体蛋白质，4 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，沉淀加15 mL蒸馏水洗涤3次，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀。用50%的乙醇溶液反复洗涤3次，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀，真空冷冻干燥24 h，得到荞麦粗蛋白粉末，收集置于4℃冰箱中备用。

2.1.2 酶法

利用张超等[23]的方法，精选甜荞籽粒500 g进行脱壳脱脂处理，磨粉后放入105℃烘箱中2 h，蒸干水分以及物料结晶水。过100目筛，得到荞麦全粉。按液料比10∶1（mL/g）添加蒸馏水，在40℃水浴上保持一段时间，保鲜膜封口防止水分蒸发。待烧杯内温度达到试验设计的温度时，缓慢加入0.5 mol/L NaOH溶液，调pH值至10.0，之后加入碱性蛋白酶，不断搅拌提取50 min，期间保持pH值恒定。将物料和浸提液转移入离心管中，4 000 r/min离心10 min。上清液用85℃水浴10 min灭酶，随后用0.5 mol/L HCl调节pH值至3.8（等电点），生成絮状沉淀，即为固体蛋白质，其它步骤同2.1.1。

2.1.3 盐浸法

参照并改进魏决等[24]的方法，精选甜荞籽粒500 g进行脱壳脱脂处理，磨粉后放入烘箱烘干。过100目筛得到荞麦全粉。按液料比10：1（mL/g）添加盐浓度为8%的NaCl溶液，在40℃水浴上保持一段时间，保鲜膜封口防止水分蒸发。待烧杯内温度达到试验设计的温度时，缓慢加入0.5 mol/L NaOH溶液，调pH值至6.5，不断搅拌提取1 h，期间保持pH值恒定。将物料和浸提液转移入离心管中，4 000 r/min离心10 min。上清液用0.5 mol/L HCl调节pH值至3.8（等电点），生成絮状沉淀，即为固体蛋白质。其它步骤同2.1.1。

2.2 甜荞蛋白质主要理化性质

2.2.1 甜荞粗蛋白的颗粒形态

采用电子显微镜进行观察，取少量甜荞蛋白质均匀地洒在双面胶上并固定于载物台，真空条件下用离子溅射喷镀仪将其喷金，于真空干燥器中干燥保存。测样时，用Nova Nano SEM-450型场发射扫描电子显微镜观察粗蛋白粒形态与结构。电镜加速电压为5.0 kV，放大倍数为5 000倍和2×104倍。

2.2.2 蛋白质组分的制备及含量测定

参照Osboren法[25]，称取5 g甜荞麦脱脂粗蛋白，加入10倍的蒸馏水，在20℃室温下用磁力搅拌器搅拌2 h，4 000 r/min离心10 min，除去沉淀，保留上清液，上清液即为清蛋白；沉淀物加入10倍体积的0.5 mol/L NaCl溶液，充分溶解后，在20℃室温下搅拌 2 h，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，上清液即为球蛋白；再向盐溶液提取的残留物中加入10倍体积的70%乙醇溶液，充分溶解后，在20℃室温下搅拌2 h，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为醇溶蛋白；之后向经乙醇溶液提取得残留物中加10倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液，充分溶解后，在20℃室温下搅拌2 h，4 000 r/min离心10 min，保留上清液即为谷蛋白。分别将上述各类蛋白溶液定容于100 mL容量瓶中，从每个容量瓶中吸取10 mL提取液，放入消解管中，然后加入3 g K2SO4，0.2 g CuSO4和10 mL浓硫酸，420℃煮90 min，冷却后通过凯氏定氮法分别进行各蛋白组分中蛋白质含量测定。粗蛋白含量测定则称取荞麦粉0.2 g，应用凯氏定氮法进行测定。

2.2.3 溶解性

参照朱慧等[26]的方法，取3个50 mL刻度离心管，分别加入25 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，然后加入0.100 g荞麦蛋白样品，于22℃左右23 000 r/min均质分散 2 min，放置30 min，4 000 r/min离心5 min，上清液分别用滤纸过滤于50 mL烧杯中，吸取1 mL样品溶液，加入4 mL双缩脲试剂，应用双缩脲反应比色测得3种溶液的蛋白质含量C0。另取3个50 mL刻度离心管，各自加入25 mL混合液（pH7.5，NaCl质量浓度为3%、蔗糖质量浓度为1%的磷酸盐缓冲溶液）。再分别加入0.1 g甜荞蛋白样品23 000 r/min均质分散2 min，放置30 min后在 4 000 r/min离心 5 min，上清液用滤纸过滤于50 mL烧杯中，吸取1 mL样品溶液，加入4 mL双缩脲试剂，应用双缩脲反应比色测得各溶液的蛋白质含量C1、C2、C3，则样品蛋白质的溶解性（protein solubility，PS，%）分别为 C1/C0×100、C2/C0×100、C3/C0×100。

2.2.4 泡沫特性

蛋白质的泡沫性能包括起泡性和泡沫稳定性。取一定量混合液，加入3%质量浓度的蛋白样品，测量溶液的体积V1，在匀质机中23 000 r/min均质2 min后，测量搅打停止时的泡沫体积V2，放置3 min后测量此时的泡沫体积V3。按式（1）、（2）计算起泡性（foaming capacity，FC）和泡沫稳定性（foaming stability，FS）。

2.2.5 乳化特性

蛋白质的乳化特性包括乳化能力和乳化稳定性。将15 mL混合液加入0.100 g的蛋白样品，用匀质机以23 000 r/min均质2 min后，加入15 mL色拉油，再在23 000 r/min均质2 min，立取10 mL的乳状液于10 mL刻度离心管中，在2 500 r/min离心5 min，取出离心管，读出乳化层的体积。按照公式（3）计算乳化能力（emulsifying capacity，EC）；将以上乳化样品于 80℃水浴30 min，取出冷却后读出乳化层高度，按照公式（4）计算乳化稳定性（emulsifying stability，ES）。

2.2.6 持水性

准确称取0.100g蛋白样品于10mL离心管中，加入5 mL混合液，用玻璃棒搅拌将样品搅匀，于2 500 r/min离心10 min，离心后除去上层清液称质量，按式（5）计算持水性（water holding，WH）。

式中：m为样品质量，g；m1为离心管和样品质量，g；m2为离心管和沉淀物质量，g。

2.2.7 持油性

准确称取0.200 g样品于10 mL离心管中，加入2 mL色拉油，20℃室温下静置1 h后，在3 500 r/min离心20 min，倒掉上清液，10 min后称量离心管和沉淀的质量，按式（6）计算持油性（fat absorption，FA）。

式中：m为样品质量，g；m1为离心管和样品质量，g；m2为离心管和沉淀物质量，g。

2.2.8 热特性

采用差示扫描量热仪（differentialscanningcalorimetry，DSC）进行，分别称取2 mg的3种方法提取的蛋白冷冻干燥制品置于铝盒中并密封，以空铝盒为对照，氮气流速20 mL/min，扫描范围是30℃～120℃，升温速率是10℃/min。对3种方法提取的蛋白质样品起始变性温度（initial temperature，Ti）、变性温度（peak temperature，Tp）和热焓值（ΔH）进行统计分析。

2.3 数据统计与分析

试验数据均为3次重复的平行样品值。数据采用SPSS19.0、Origin 9.1进行统计分析，显著性差异检验采用（least significant difference，LSD）最小显著差异法（P＜0.05）进行分析。

3 结果与分析

3.1 甜荞粗蛋白的颗粒形态

3种方法提取的甜荞粗蛋白粉如图1所示。

图1 3种提取方法得到的蛋白质粉末Fig.1 Buckwheat protein powder of 3 kinds of extraction methods

通过感官比较可以看出，碱溶酸沉法得到的甜荞籽粒粗蛋白呈现暗黄色；酶法则表现为棕褐色；盐浸法则呈现为白色。3种提取方法所得的蛋白质颗粒形态见图2。

由图2可知，不同提取方法得到的甜荞蛋白质颗粒形态有一定差异，蛋白质整体呈现出不规则形状。碱溶酸沉法和酶法提取的蛋白质颗粒整体都偏大，前者孔隙小且多，后者孔隙大且数量适中；盐浸法提取的蛋白质颗粒最小且表面相对较光滑平整。前两种方法提取的蛋白表面有鳞片状突起，可能因为氢氧化钠对甜荞籽粒蛋白质有一定的刺激和影响，增大了蛋白质的表面积，从表面特征可以推断碱溶酸沉法和酶法得到的甜荞籽粒蛋白具有较强的持水性和吸油性。Shuo Chen等[27]通过碱溶酸沉法提取大豆蛋白质，发现不同的样品表现出相似的颗粒形貌，姜黄素结合对颗粒聚集没有产生明显的影响。Stathopulos等[28]研究了蛋白质的超声作用导致类似淀粉样蛋白的聚集体的形成，且发现超声引起的聚集量与超声处理的程度成正比。Shulai Lu等[29]以牛血清白蛋白为模板，通过使用扫描电子显微镜观察了具有磁化率的蛋白颗粒形貌，研究了效果分散剂的种类和数量、搅拌速度、引发剂的数量和添加方法等对蛋白颗粒形貌的影响。扫描电镜照片显示，得到的蛋白颗粒均为球形。不同的是，该试验研究的是湿条件下的蛋白颗粒形貌，而本研究所用的材料是冷冻干燥后的蛋白粉末，因此结果会有所不同。

图2 3种提取方法得到的蛋白质颗粒形态Fig.2 Buckwheat protein′s particle morphology of 3 kinds of extraction methods

3.2 蛋白质及其各组分含量

3种提取方法所得粗蛋白及清蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白含量如图3所示。

图3 3种提取方法所得粗蛋白及清蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白含量Fig.3 Buckwheat protein′s crude protein，albumin，gliadin，globulin and gluten content of 3 kinds of extraction methods

由图3可知，利用碱溶酸沉法提取的甜荞粗蛋白含量最多，为68.28%，显著高于酶法和盐浸法；酶法制得的蛋白质中醇溶蛋白和谷蛋白含量最高，分别为4.62%和43.91%，显著高于其它两种方法，而小麦面筋主要由麦醇溶蛋白和谷蛋白组成[30]。因此，由酶法提取的蛋白质在食品加工方面可能会有更好的面筋特性；利用盐浸法提取的甜荞粗蛋白较高，且清蛋白含量最高，为25.01%，且显著高于碱溶酸沉法和酶法制得的蛋白质，这有可能是加入蒸馏水后导致盐浓度降低，出现盐溶现象使溶解的清蛋白含量增多。

3.3 溶解性

3种提取方法对蛋白质溶解性的影响见图4。

图4 3种提取方法得到的蛋白质溶解性Fig.4 Buckwheat protein′s solubility of 3 kinds of extraction methods

由图4可知，利用碱溶酸沉法、酶法、盐浸法提取的甜荞蛋白质溶解性存在显著差异。蛋白质溶解性主要是蛋白质在水中以分散态存在，在水中的分散量或分散水平。碱溶酸沉法提取的蛋白质溶解性最高，为68.75%，显著高于酶法和盐浸法提取的蛋白质溶解性，说明提取蛋白质的pH值环境较为适宜，并没有对蛋白质的溶解性造成太大破坏。盐浸法属于物理提法，它提取的蛋白质溶解性偏低，为34.41%，可能是由于盐离子中和了蛋白质的电荷，破坏了双电层的水化膜，蛋白质分子间聚集沉淀析出，使溶解性降低。酶法提取的蛋白质溶解性最低，只有24.54%，一是因为采用酶法提取时，需要给碱性蛋白酶提供强碱环境，破坏了蛋白质的某些理化特性；二是酶法提取结束后需要高温水浴灭酶，防止蛋白质进一步被酶分解，加热使得蛋白质分子在疏水作用下分子展开，并通过疏水作用和二硫化物的形成而使分子折叠，从而增加了蛋白质的表面疏水性，使得溶解性降低[31]；Cherry等[32]也研究报道了充分加热脂肪花生种子在100℃～120℃的水中浸泡15 min会降低蛋白质溶解性，与本研究结果一致。

图5 3种提取方法得到的蛋白质泡沫特性Fig.5 Buckwheat protein′s foaming capacity and stability of 3 kinds of extraction methods

3.4 泡沫特性

3种提取方法对蛋白泡沫特性的影响见图5。

蛋白质的起泡性是由于蛋白质分子间的范德华力、分子中的羧基与氨基之间的氢键能降低相的表面的张力，从而形成稳定的泡沫。由图5可知，利用碱溶酸沉法、酶法、盐浸法提取的甜荞蛋白质泡沫特性存在显著差异，起泡性分别为20.67%、58.67%、81.33%；泡沫稳定性分别为70.56%、61.35%、85.28%。在起泡性的测定中，盐浸法所得蛋白的起泡性最好，达到了81.33%，显著高于碱溶酸沉法和酶法，这可能是由于盐浸法提取蛋白质时的pH值偏酸性，而荞麦蛋白在偏酸性条件下的发泡性较好[33]，其次是酶法，起泡性最差的是碱溶酸沉法；在起泡稳定性的测定中，盐浸法表现最好，其次是碱溶酸沉法，表现最差的是酶法。蛋白溶解性的好坏决定起泡性好坏，但溶解性最好的碱溶酸沉法得到的蛋白质的起泡性最差，这可能是由于碱溶酸沉法得到的蛋白中脂肪未去除干净，较多的脂类严重影响蛋白的起泡性能，阻碍泡沫的产生和稳定[34]。综合以上两个评价指标，盐浸法更适合用于蛋糕、棉花糖、面包等对起泡性能要求较高的食品加工的蛋白质的提取。

3.5 乳化特性

3种提取方法对蛋白乳化特性的影响见图6。

图6 3种提取方法得到的蛋白质乳化特性Fig.6 Buckwheat protein′s emulsifying capacity and stability of 3 kinds of extraction methods

由图6可知，利用碱溶酸沉法、酶法、盐浸法提取的甜荞蛋白质乳化能力分别为62%、51.67%、49.67%；乳化稳定性分别为97.33%、85.18%、94.62%。3种方法所得到的蛋白质都有良好的乳化能力和乳化稳定性。在乳化性测定中，碱溶酸沉法的乳化能力（EC）最高且显著高于其它两种方法，而酶法和盐浸法的乳化能力相差不大。乳化稳定性的测定中，3种方法所得蛋白乳化稳定性（ES）测定结果均在85%以上，其中碱溶酸沉法和盐浸法的乳化稳定性最强，达到了94%以上，说明3种方法所提蛋白都可以较好地长时间保持其乳化作用。Nakai等[35]报道，乳化特性不仅取决于蛋白质的溶解性，还取决于特定蛋白质的亲水亲脂平衡。提取方法不同，粗蛋白中每种分离蛋白含量不同，且样品中残留的脂质可能对蛋白质的亲水亲脂平衡影响更大，因此整体都具有较高的EC和ES值。蛋白质乳化作用在一定程度上是与它的溶解性相关，溶解性良好的蛋白质才能表现出良好的乳化性质。在本试验中，溶解性最佳的提取蛋白质所用方法是碱溶酸沉法，这与乳化性质的测定中表现最好的是碱溶酸沉法相符。综合考虑乳化能力和乳化稳定性两个因素，碱溶酸沉法所提取的粗蛋白乳化特性最佳，这种方法更适合用于冰激凌等甜品的制作，能更好地防止制品中冰结晶的扩大并促使质地圆滑。

3.6 持水性

3种提取方法对蛋白持水性的影响见图7。

图7 3种提取方法得到的蛋白质持水性Fig.7 Buckwheat protein′s water holding capacity of 3 kinds of extraction methods

如图7所示，3种方法提取的蛋白质的持水性均较高，且存在显著性差异，持水性最好的是酶法提取的蛋白质，为532.54%，且显著高于其它两种方法；其次是碱溶酸沉法，为447.95%；盐浸法的持水性最差，为255.88%，显著低于其它两种方法。持水性的大小主要依赖于蛋白质的表面结构，碱溶酸沉法和酶法提取的蛋白质颗粒比盐浸法提取的蛋白质的颗粒孔隙数量多，且表面上有鳞片状突起，而盐浸法提取的蛋白质相对表面平整光滑，所以前两者蛋白质表面积较大，而酶法制得的蛋白质颗粒较小，因而表面积更大，得到的蛋白质具有更强的持水性。由于食品加工品质主要受蛋白质持水性能的影响，如火腿肠中蛋白质所能持有的水分越多，口感越鲜嫩，因此酶法提取的蛋白质更有利于食品生产。

3.7 持油性

3种提取方法蛋白持油性的影响见图8。

图8 3种提取方法得到的的蛋白质持油性Fig.8 Buckwheat protein′s fat absorption capacities of 3 kinds of extraction methods

如图8所示，3种方法提取的蛋白质的持油性均较高，且存在显著性差异，持油性最好的是酶法提取的蛋白质，为343.15%，且显著高于其它两种方法；其次是碱溶酸沉法，为194.33%；盐浸法的持油性最差，为186.20%，显著低于其它两种方法。蛋白质持油性表示其吸附油脂能力的大小，这与它们的表面结构也有关。碱溶酸沉法和酶法提取的蛋白质颗粒比盐浸法提取的蛋白质的颗粒孔隙多且表面凹凸不平，而盐浸法提取的蛋白与前两者相比表面相对平整光滑，导致前两者蛋白质表面积较大，而酶法制得的蛋白质颗粒较小，因而表面积更大，得到的蛋白具有更强的持油性。蛋白质的持油性对于火腿肠等含油食品的品质有重要的影响，Tomotake等[36]研究发现荞麦持油性高于大豆蛋白，说明其吸油性较强，因此荞麦蛋白可能是功能蛋白在食品中的潜在来源。因此，酶法制得的蛋白质更适合作为一种功能蛋白添加到含油食品中。

3.8 热变性

3种提取方法对蛋白热变性的影响见表1。

表1 3种提取方法得到的蛋白质热变性Table 1 Comparison of buckwheat protein′s thermal denaturation of 3 kinds of extraction methods

如表1所示，3种提取方法制得的蛋白质在起始变性温度（Ti）和变性温度（Tp）上并无显著性差异，说明3种方法提取的蛋白质二、三级结构的改变，包括：α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲结构的比例发生改变的温度无显著性差异，即α-螺旋结构的相对强度减小，β-折叠和无规则卷曲结构相应增多的节点温度无显著差异；酶法制得的蛋白质热焓值（ΔH）最高，且显著高于其它两种方法，说明具有更好的热稳定性[37]。

4 结论

3种不同方法提取甜荞蛋白质，其蛋白质理化性质有所不同。碱溶酸沉法制得的甜荞蛋白质溶解性好、乳化特性强，显著高于其它两种方法制得的蛋白质；酶法制得的蛋白质持水性和持油性高，ΔH最高，热稳定性最强，显著高于碱溶酸沉法和盐浸法制得的蛋白质；盐浸法在泡沫特性方面最好，但在持水性和持油性方面表现最差。因此，不同方法提取的甜荞蛋白质在食品加工过程中具有不同的性质。综合分析，碱溶酸沉法和酶法是较适宜的提取甜荞蛋白质的方法。