LF通过抑制FLC促进拟南芥开花的初步研究

高 娜

(甘肃中医药大学 定西校区药学教学部，甘肃 定西 743000)

0 引言

开花的发生决定了高等植物具备繁殖和遗传的能力，对植物个体和子代的发育具有重要的意义.作为高等植物的模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)属于十字花科芸薹属，目前已发现拟南芥中开花相关基因位点有80个，其中有20个是和晚花相关[1-3].通过对这些基因功能的研究，发现了调控开花的一些遗传途径和相关的调节因子，加快了对于拟南芥甚至于高等植物花期发生和转变的研究步伐[4-6].本实验针对拟南芥lf突变体生长周期缓慢，花期推迟的生理现象，通过3周的春化处理观察其花期变化，并采用Q-PCR技术在基因转录水平上分析了LF基因和开花抑制基因FLC的关系，初步分析并确定LF作为正调控基因通过抑制FLC偶联春化途径参与了拟南芥开花的调控.

1 材料与方法

1.1 植物材料及培养条件

本实验中使用的晚花突变体材料lf及LF基因超表达材料35S：：LF均来自兰州大学生命科学院.本实验中使用的拟南芥野生型Col、晚花突变体材料lf及LF基因超表达材料35S：：LF均来自兰州大学生命科学院.

选择饱满的种子悬浮在0.1%的琼脂液中，于4 ℃冷处理72 h，之后将其播种至土壤中.根据不同的实验目的，选择不同的光周期条件，包括长日照(16 h光照/8 h黑暗)和短日照条件(8 h光照/16 h黑暗)，温度保持在22 ℃左右，相对湿度为70%～90%.

1.2 方法

1.2.1 开花时间的统计

本实验分别统计了长日照和短日照培养条件下野生型Col，lf和35S：：LF在花茎1 cm时的莲座叶数目和相应的开花天数，并据此计算出相应的平均值和标准误差.

1.2.2 春化处理

种子种植在MS平板上，4 ℃暗处理3周后移栽至土壤中，并在长日照条件下统计开花数据.

1.2.3 荧光定量PCR(Q-PCR)分析相关基因的表达量

1.2.3.1 实验材料的选择

开花基因FLC表达量分析：长日照选择生长14 d的幼苗，在控时因子为16 h时提取叶片部位的RNA；短日照则选择生长17 d的幼苗，在控时因子为8 h时提取叶片部位的RNA，后续处理一致.

春化处理后基因表达量分析(FLC)：选择突变体和野生型均出现4～5片莲座叶时，提取幼苗的RNA.

1.2.3.2 荧光定量PCR(Q-PCR)

本实验选用E.Z.N.ATM植物RNA提取试剂盒来提取总RNA，cDNA第一链合成时的试剂盒为TaKaRa公司提供的PrimeScriptTMRT-PCR Kit，RNA提取及cDNA第一链合成条件参见文献[7].使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ来做定量PCR实验，所用的引物序列为：FLC-F：GACTAGAGCCAAGAAGACCG；FLC-R：GAAGATTGTCGGAGATTTGT(Sequences(5′→3′)).

2 结果

2.1 不同光周期lf突变体花期变化分析

在长日照和短日照条件下，分别观察野生型Col、超表达材料35S：：LF及缺失突变体lf的花期，并统计相应的开花数据.图1结果显示：不同光周期的lf突变体花期都迟于野生型.长日照推迟17 d，抽薹时莲座叶数目比野生型多了7片(图1-A和1- B)；短日照推迟40 d，莲座叶多了12片(图1-C和1-D).35S：：LF比野生型更早抽薹，长日照提前6 d，莲座叶减少了3片(图1-A和1-B)；短日照提前了20 d，莲座叶也少了10片(图1-C和1-D).

2.2 lf突变体中开花整合因子FLC转录水平的检测

为更进一步分析LF在开花调控中的作用，运用Q-PCR技术检测了拟南芥关键控花因子FLC的表达量.图2结果显示：开花抑制因子FLC在不同光周期的lf突变体中都有很高的表达量，长日照高于野生型2倍，短日照甚至达到4.4倍，其表达量升高完全对应于lf晚花表型；提前开花的超表达材料中FLC的表达量低于野生型，长日照降低了32%，短日照则降低了65%(图2-A和2-B).

2.3 lf突变体春化处理后花期及FLC转录水平分析

lf晚花突变体中FLC的表达水平较高，表明该突变体可能对于春化作用敏感.

图3的结果表明：3周的春化处理后发现：Col莲座叶数目仅减少2片，花期没有明显提前，内源的FLC表达量也基本上没有变化.已报道Col和其他拟南芥生态型不同，其对于春化效应不敏感，且内源的FLC水平极低[6]；lf莲座叶数目减少了8片，花期明显提前(图3-C)，且FLC处理后明显下调，降幅为40%，表明LF通过FLC调控的春化途径参与了拟南芥开花(图3-D).

3 讨论

高等植物的开花过程是分别响应于环境因素和内在调控因子的，是一个复杂且精密的生物反应过程[8].目前已经确定在拟南芥中存在6条开花遗传途径，即光周期途径、赤霉素途径、春化途径、温度途径、年龄途径和自主途径[9-12].在各条遗传途径相互作用的过程中，存在一些关键的整合因子，如FLC、SOC1、FT以及下游的LFY，它们使得各条途径相互交叉发挥协同作用，共同控制开花[13-14].FLC整合了自主途径和春化途径，作为一个关键的开花抑制因子，其表达量与对开花的抑制程度呈正相关[15-17].在本实验中，lf突变体晚花的现象与其内源FLC转录水平的变化是一致的，显示其缺失突变体晚花极有可能因为FLC高水平的表达所致，而LF基因是作为正调控因子可抑制FLC的表达从而调控拟南芥开花.

春化作为一个很重要的环境因素，可以很大程度上促进拟南芥的开花[18].需春化的拟南芥生态型及突变体，它们对于春化的需求是因为内部高的FLC表达水平所致[19]，已报道的响应于春化效应的生态型C24，植株略晚花，但其内源的FLC的表达水平却很高，亦可以被低温处理提前花期[20].本实验中春化处理lf突变体中FLC的表达水平下降了40%，在一定程度上逆转晚花表型，亦表明LF通过FLC调控的春化途径参与拟南芥开花.因此，根据突变体晚花表型和FLC基因的Q-PCR检测结果，初步推测出LF调控开花的方式可能是通过抑制FLC的转录水平且偶联了春化途径，作为一个正向因子参与拟南芥花期调控.