西瓜枯萎病田间调查及其病原菌鉴定

陈燕萍 刘欣 肖荣凤 朱育菁 刘波

摘 要：对福建省4个地区种植西瓜实生苗田块的枯萎病发病率进行调查，结果表明：西瓜枯萎病的田间平均发病率在18.5%～38.2%。从不同地点采集的发病植株上共分离、纯化和保存了31株菌株，结合菌株的形态学特征、镰刀菌属特异引物Fu3/Fu4和尖孢镰刀菌特异性引物FOF1/FOR1检测以及致病性测定，确定了尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum为福建省西瓜枯萎病的主要病原菌，其中尖孢镰刀菌占总分离菌株数量的93.54%。

关键词：西瓜;枯萎病;发病率;病原鉴定

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）08-0032-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.08.007

Abstract： The incidence of Fusarium wilt in the fields of planting the watermelon seedlings at the 4 regions of Fujian Province was investigated. The results showed that the average incidences of Fusarium wilt was from 18.5% to 38.2% in the different fields. A total of 31 strains were isolated， purified and preserved from the diseased plants collected from the different sites. Fusarium oxysporum was identified as the main pathogen of Fusarium wilt of watermelon in Fujian Province based on the morphological characteristics， PCR amplification of the specific primers Fu3/Fu4 for Fusarium gene and FOF1/FOR1 for Fusarium oxysporum， and the pathogenicity test. And Fusarium oxysporum accounted for 93.54% of the total number of isolated strains.

Key words： Watermelon; Fusarium wilt; Incidence; Pathogen identification

西瓜是福建省的主要經济作物之一，据不完全统计福建省西瓜年均栽培面积约3.5万hm2以上，产量约130万t以上[1]。随着西瓜种植年限的增加，连作障碍愈发凸显。其中，由土传病原菌引起的西瓜枯萎病发病率呈逐年上升趋势，普遍发病率为10%～30%，严重者高达50% 以上甚至绝产[2-3]。枯萎病在西瓜整个生育期均可发生，以伸蔓期至开花坐果期发病最为严重[4]。已有研究对西瓜枯萎病病原菌进行了分离与鉴定，研究结果表明，从病株上可分离获得尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、茄病镰刀菌F.solani和串株镰刀菌F.moniliforme等镰刀菌属菌株，但均表明尖孢镰刀菌是其主要病原菌[3，5]。由于镰刀菌属种类繁多、形态各异，仅依靠形态特征难以对其进行准确的分类鉴定。近年来，利用核糖体转录间隔区序列rDNAITS、翻译延伸因子EF1α

和RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基rPB2等基因位点的核酸序列进行PCR测序为镰刀菌属种类的准确鉴定提供了便利[6-8]。但是，镰刀菌属特异引物Fu3/Fu4和尖孢镰刀菌特异性引物FOF1/FOR1，可分别快速、批量、准确地鉴定到镰刀菌属水平以及尖孢镰刀菌种水平[9-10]。因此，为了解福建省西瓜枯萎病的发病情况和主要病原菌种类，本研究调查了福建省内多地的西瓜枯萎病的发病情况，并通过形态学、特异性引物分子鉴定及致病性测定等方法，进行西瓜枯萎病病原菌的种类鉴定。

1 材料与方法

1.1 供试材料

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g，定容至1000 mL;真菌基因组DNA的提取试剂盒（DP2031）购自北京百泰克生物技术有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix购自全式金生物技术有限公司;所用引物均由上海博尚有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 西瓜枯萎病田间发病率调查及采样 2017-2020年间，调查福建省三明市泰宁县（山地，新地），福州市平潭县（沙滩地，轮作1年）、琅岐镇（水田，轮作1年）和永泰县（水田，轮作2年）等地西瓜主要种植区的西瓜枯萎病发生情况与病害症状，调查面积为2000～3335 m2。并采集西瓜枯萎病发病初期的病株样本带回实验室进行病原菌的分离鉴定。

1.2.2 病原菌的分离与形态学鉴定 采用常规组织分离法进行病菌分离。从不同地点采集的西瓜病株截取地上部距离土面3～5 cm处的茎部组织，切取病健交界处组织块各30片，每片约为0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm大小的薄片，经75%酒精处理2～3 s，再用1%次氯酸钠处理3～5 min后，用无菌水清洗3遍，置于含200 μg·mL-1硫酸链霉素的PDA培养基上培养，每皿放5片病组织，于（25±1.5）℃培养2～3 d;从不同地点采集的分离平板中随机挑选典型特征的分离物，接种于新的PDA平板上，并经单孢分离获得纯培养，菌株编号后于-80℃甘油冷冻保存。形态学鉴定参照Leslie等的方法[11]：在PDA培养基接种病原菌纯培养物，25℃恒温培养7 d，观察菌落特征，于显微镜下观察分生孢子的种类和形态，并测量病原菌的孢子大小。

1.2.3 病原菌的分子鉴定 取培养7 d的各菌株菌丝体参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行菌株总DNA提取。

镰刀菌属的鉴定[9]：采用镰刀菌鉴定的特异性 引物Fu3/Fu4序列CCGAGTTTACAACTCCCAAA/TCCTCCGCTTATTGATATGC进行菌株DNA的PCR扩增，目的片段约为520 bp。25 μL PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL，引物各1 μL（10 μmol·L-1），DNA模板1 μL，用ddH2O定容至25 μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环;最后72℃延伸10 min。

尖孢镰刀菌种的鉴定[10]：采用尖孢镰刀菌鉴定的特异性引物FOF1/FOR1序列ACATACCACTTGTTGCCTCG/CGCCAATCAATTTGAGGAACG进行菌株DNA的PCR扩增，目的片段约为340 bp。25 μL PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL，引物各1 μL（10 μmol·L-1），DNA模板1 μL，用ddH2O定容至25 μL。PCR扩增程序：94℃预变性60 s;94℃变性60 s，58℃复性30 s，72℃延伸60 s，共25个循环;72℃延伸7 min。

1.2.4 病原菌的致病性测定 保存的各菌株扩大培养后分别配成浓度为1.0×106 cfu·mL-1孢子悬浮液，采用伤根浇灌法接种西瓜植株，植株大小以地上部株高约为10 cm，每株浇菌液20 mL，以清水处理为对照，各菌株处理30株，置于25～28℃的温室中进行培养，逐日观察发病情况，计算发病率，从发病株上重新分离病原物，并根据1.2.3进行病原菌鉴定。

2 结果与分析

2.1 西瓜枯萎病田间发病率调查及采样

西瓜枯萎病苗期即可开始发病，开花结果期至果实成熟期发病最为严重。发病初期田間症状表现为病株茎蔓上叶片自基部向前逐渐萎蔫，似缺水状，早晚尚能恢复正常;发病中期萎蔫不可恢复，叶片和茎蔓萎蔫，根部及根茎部表皮组织轻微开裂，维管束呈浅褐色;发病后期根部坏死，茎表皮完全开裂褐变，维管束坏死，整株枯死（图1）。不同地区种植西瓜实生苗枯萎病的田间平均发病率调查结果表明，泰宁县山地种植的发病率为18.5%，平潭县沙滩地种植的发病率为25.8%，琅岐镇大棚种植的发病率达38.2%，永泰县水田种植的发病率20.6%。

2.2 病原菌的分离与形态学鉴定

经单孢分离，挑取有代表性的31个菌株进行-80℃冷冻保存。所分离的菌株在PDA培养基上生长7 d，菌丝体白色棉絮状（图2A）。产孢细胞短，单瓶梗（图2B）;小型分生孢子呈椭圆形或卵圆形，0～1个隔膜，大小9.8（6.2～20.7）μm×2.6（2.1～3.7）μm;大型分生孢子镰刀形或纺锤形，有足胞，1～4个隔膜，多为3个隔膜，大小为30.3（22.8～39.9）μm×3.6（3.2～5.5）μm（图2C）。初步确定这些分离物为镰刀菌（Fusarium spp.）。

2.3 病原菌的分子鉴定

对从不同地区采集的31株西瓜枯萎病病原菌进行属、种分子鉴定，结果（表1）表明，采用镰刀菌Fu3/Fu4特异性引物鉴定，供试菌株均获得1条大小约为520 bp的条带，与目的片段大小相似，证明供试菌株均为镰刀菌（图3A）;进一步利用尖孢镰刀菌特异性引物FOF1/FOR1鉴定，除菌株FJAT30281和FJAT30288外，其余菌株均获得1条大小约为340 bp的条带，与目的片段大小相似，证明这29株菌株均为尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌占总数的93.54 %（图3B）。

2.4 病原菌的致病性测定

供试菌株采用伤根浇灌接种回接西瓜实生苗，结果表明菌株的致病性存在差异（图4）。菌株FJAT30281和FJAT30288（非尖孢镰刀菌）处理组和对照组植株不发病;其余供试菌株均可使西瓜植株发病，但发病率有差异，接种7 d后不同菌株处理组陆续开始发病，表现为下部叶片先呈现萎蔫症状;接种14～18 d，17个强致病性菌株处理组植株完全萎蔫，发病率均达100%;另外12个菌株处理组接种25 d后仍有部分植株未表现发病症状，发病率在60.00%～93.33%（图5A）。致病菌株处理的植株根茎部出现褐变且横切后茎部维管束可见明显褐变，而清水对照CK处理组的植株未变色（图5B、5C）。重新分离均获得与接种物相同的分离物，符合柯赫氏法则。

3 讨论

西瓜枯萎病在我国西瓜产区均可发生，发病严重程度会因种植地区、种植方式和品种等差异而不同[3，12-13]。本研究调查发现福建省内4个地区的西瓜枯萎病平均发病率存在差异，平均发病率在18.5%～38.2%，可能与不同地区土壤类型、气候特点和品种有关。从不同地区采集的西瓜枯萎病株上分离纯化的31株菌株经形态学、特异性引物分子检测及致病性测定等方法，确定了尖孢镰刀菌为福建省西瓜枯萎病的主要病原菌，其中尖孢镰刀菌占总分离菌株数量的93.54 %，另外也分离到2株其他镰刀菌，与纪莉景等[3]以及杜若琛等[5]的研究结果类似。纪莉景等[3]研究表明，从西瓜枯萎病发病初期的病组织中分离得到尖孢镰刀菌的概率较大，而发病后期整株植株完全萎蔫时，还有可能分离少量其他腐生菌。本研究从4个地点采集的田间初发病植株，除泰宁地区样本中分离到2株非尖孢镰刀菌外，其余3个地点分离的菌株均为尖孢镰刀菌，同样证明了从初发病植株更容易获得尖孢镰刀菌。根据以往分离鉴定经验，地下根茎部及靠近土面的茎部组织中容易分离到其他腐生菌，离土面越远的组织分离到强致病菌株的概率越大，本研究采用的是截取植株地上部距离土面3～5 cm处的茎部组织进行分离，因此，分离到的尖孢镰刀菌数量较高。除了传统的病原菌鉴定方法，本研究主要采用镰刀菌属和尖孢镰刀菌种类的特异引物鉴定，使得病原菌的鉴定结果更为可靠，鉴定效率更高，可为病原菌快速鉴定和田间西瓜枯萎病的防治提供技术支持。

参考文献：

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（责任编辑：柯文辉）