高通量测序技术分析腌渍白菜液中原核微生物群落结构

贾晶晶，易洋，韩睿媛，燕平梅

(太原师范学院 生物系，山西 晋中 030012)

我国通过制作腌渍白菜来存储蔬菜的历史久远，甚至可以追溯到商朝[1]。蔬菜腌渍的原理是利用食盐的高浓度和高渗透压来进行腌制，研究表明，成品腌渍菜在与空气隔绝的情况下，在温度20 ℃以下，食盐含量在12%～15%时，能够保藏180 d以上，并能长期保藏[2]。高盐食品之所以能够较长时间地保存而不致于质地软化，最主要的原因是高食盐的高渗透压对有害微生物的抑制作用，从而可以有效阻止有害微生物分泌的酶对食品细胞结构的破坏[3]。腌渍白菜是以白菜为原料，利用有益微生物的活动赋予白菜特殊的风味和营养价值对白菜进行保藏的一种方式。腌渍蔬菜不仅可以提高蔬菜的利用率，还能使蔬菜的食用保质期得以延长，此外，腌渍蔬菜极具风味、易于保存。它制作方法简便，风味独特，适量食用还可调节肠胃，增强食欲，能为人体提供充足的营养物质[4]。

我国腌渍蔬菜产业从原料选取、发酵腌渍工艺、产品保藏到加工管理均存在诸多不足[5]。尤其是其中存在的食品安全问题[6-7]，严重制约其大规模的工业化发展。而要促进腌渍白菜由自然发酵到大规模生产的转变，对于自然发酵腌渍白菜的微生物群落结构的研究是十分必要的[8-9]。从20世纪80年代起至今，腌渍白菜中微生物群落结构的研究一直备受关注[10]。随着分子生物学的蓬勃发展，高通量测序等技术逐渐被应用于腌渍蔬菜中微生物的研究[11-12], 食盐在为腌渍白菜增味的同时，还起到脱水和防止杂菌污染的作用，与腌渍白菜中亚硝酸盐含量和微生物群落结构息息相关[13]。本次实验采用高通量测序技术研究12%食盐浓度对腌渍白菜液微生物群落结构的影响，发现高食盐浓度腌渍白菜液中的优势微生物，对保障食品安全、提高人民健康水平是十分必要的，为推动我国腌渍白菜产业的大规模工业化发展提供了数据参考，以促进腌渍蔬菜的科学可持续发展[14-15]，更好地为食品安全和人民健康服务。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

白菜、无碘食盐：购于山西省太原市解放路永辉超市；DNA提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 实验仪器

DYY-6C琼脂糖凝胶电泳仪：北京六一仪器厂；离心机：美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腌渍白菜的制作

本实验采用传统自然发酵方法腌制：将购买的新鲜白菜修整、洗净、沥干并切分成片状备用。将选好的腌渍白菜坛用开水烫洗2次备用。将预处理过的白菜取200 g装入腌渍白菜坛中，并加入12%浓度的食盐水直至淹没全部白菜，盖好坛盖。然后将坛盖密封，保证发酵在适宜条件下进行。同时设置3个平行实验，发酵14 d。

1.2.2 样品采集及样品DNA的提取

待腌渍白菜发酵至14 d时，用5 mL的无菌移液器分别从腌渍白菜坛的上、中、下三部分的随机位置各吸取12 mL发酵液，共计36 mL发酵液于离心管中，设置10000 r/min离心10 min，倒掉上清液，用1.5 mL的EP管存放离心得到的菌体。将3个平行实验得到的菌体均匀混合，备用。最后根据DNA提取试剂盒的要求对收集到的混合菌体进行DNA的提取。提取成功后用0.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测并测定其DNA的浓度。

1.2.3 高通量测序

将提取得到的DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.2.4 数据分析

根据97%相似性，将非重复序列进行操作分类单元(OTU)聚类。然后采用RDP Classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计12%食盐浓度腌渍白菜的微生物在不同水平的群落组成。利用Mothur软件绘制稀释性曲线，利用QIIME软件计算样品的各种多样性指数，利用Excel软件构建群落分布柱状图、数据分析表等。

2 结果与分析

2.1 腌渍白菜中微生物群落结构组成

分别在不同水平对样品的群落组成进行统计分析，所得结果表明：样品中共有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)6个菌门。整理分析12%食盐浓度发酵的腌渍白菜中微生物群落在门水平的相对含量数据表(见表1)和柱状图(见图1)。

表1 12%食盐浓度的腌渍白菜微生物群落 在门水平上的相对含量

图1 12%食盐浓度的腌渍白菜微生物群落 在细菌门水平上的相对含量Fig.1 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the phylum level with 12% salt concentration

由表1和图1可知，变形菌门(67.01%)含量最高，厚壁菌门含量(32.39%)次之，芽单胞菌门含量最低。由此认为，12%食盐浓度腌渍白菜中变形菌门为最优势菌门。

表2 12%食盐浓度腌渍白菜微生物群落 在纲、目水平上的相对含量Table 2 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the class and order levels with 12% salt concentration

通过对样品在纲和目水平的微生物群落分布的统计分析(见表2)可知，在变形菌门中，主要优势菌纲为Gammaproteobacteria，其含量高达99.17%，其中Enterobacteriales(72.05%)含量最高，Alphaproteobacteria含量较少，未统计到Deltaproteobacteria。而厚壁菌门中Bacilli(99.99%)为主要优势菌纲，该纲中Lactobacillales(86.05%)含量最高，Clostridia含量较少。变形菌门与厚壁 菌门的相对含量高达99.40%，再次是拟杆菌门(0.57%)，其中均为Bacteroidia，Sphingobacteriales的含量最高，未检测到Bacteroidales细菌。而放线菌门、蓝藻菌门和芽单胞菌门的含量都很少，约占总含量的0.02%。

12%食盐浓度发酵的腌渍白菜中细菌在属水平上的分布见图2。

图2 12% 食盐浓度腌渍白菜水中的细菌 在属水平上的相对含量Fig.2 The relative content of bacteria in the pickled Chinese cabbage liquid at the genus level with 12% NaCl concentration

由图2可知，乳球菌属(Lactococcus)含量最高，为最优势菌属，约占总体的26.45%。第二优势菌属为普罗威登斯菌属(Providencia)，含量约占样本总体的24.89%。再其次为肠杆菌属(Enterobacter)，约占总体的21.28%。另外，肠杆菌科中还有未分类的菌属，占样本总数的12.06%。此外，还有Lelliottia(1.23%)，Acinetobacter(1.29%)，Delftia(1.29%)，Comamonas(1.22%)，Weissella(0.26%)，Bacillus(3.62%)等菌属。样本微生物群落中Aerococcus，Christensenellaceae_R-7_group，Bacteroides，Rikenellaceae_RC9_gut_group，Cloacibacterium，Bifidobacterium，Cutibacterium，norank等菌属含量均为0。

2.2 腌渍白菜中微生物多样性分析

从所得有效序列中随机选取一定数量进行稀释曲线的绘制(见图3)，可以看到曲线趋于平缓，即认为测序结果能够基本反映出腌渍白菜中细菌的丰富度及多样性。

图3 不同食盐浓度样品的稀释曲线Fig.3 The dilution curves of samples with different salt concentration

通过分析样品测序所得序列，计算样品的各项多样性指数，见表3。

表3 12% 食盐浓度腌渍白菜中Alpha多样性指数Table 3 The Alpha diversity indexes of pickled Chinese cabbage with 12% NaCl concentration

由表3可知，12%食盐浓度腌渍白菜的香农指数较低。而12%食盐浓度腌渍白菜的辛普森指数较高。综合分析认为，12%食盐浓度腌渍白菜的微生物多样性较低。原因可能是食盐浓度的不同造成腌渍白菜水的渗透压不同，影响了发酵过程中微生物群落结构的组成。

3 结论

本文通过高通量测序研究12%食盐浓度腌渍白菜液中原核微生物群落结构。结果表明，12%食盐浓度发酵的腌渍白菜中包含6个菌门，其中变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)和杆菌(Bacilli)为其主要优势菌纲，普罗威登斯菌属(Providencia)和乳球菌属(Lactococcus)为最优势菌属。