MPTP致帕金森病小鼠嗅觉障碍的机制研究

祝娃娃，王健达，张险峰，俞灵莺

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常见的神经退行性疾病之一，PD主要表现为锥体外系运动障碍，其主要特征为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等运动症状，中脑黒质( substantia nigra，SN)致密带多巴胺(dopamine，DA)能神经元的大量丢失是促进帕金森病临床进展的主要因素[1,2]。但是随着研究的深入，人们逐渐发现PD患者还会表现出一系列的非运动症状，例如抑郁、焦虑、便秘、认知障碍、睡眠障碍、嗅觉减退等[3,4]。有文献报道在这些非运动症状中，嗅觉减退的发生率最高，可达到70%～90%[5,6]。既往研究表明，除了在黑质-纹状体系统存在多巴胺，在嗅球等部位也有分布，很多PD患者嗅觉障碍可能会早于运动症状出现[7]。但是目前对PD嗅觉障碍的具体机制尚未完全清楚。本文研究旨在观察MPTP小鼠的嗅觉障碍以及其与嗅球中DA能神经元的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组和处理 健康、雄性C57BL/6J小鼠16只,动物来源：上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物实验合格证：SYXK(浙)2018-0012，SPF级，体重(20±2) g，随机分为两组(n=8)：(1)对照组(control)；(2)模型组(MPTP)。模型组腹腔注射MPTP 14 mg/(kg·次)，一共注射4次，每次需要2 h的间隔时间，要在1 d时间内注射完毕(急性模型剂量和给药)。对照组给予等量的生理盐水。

1.2 行为学观察 各组小鼠在MPTP急性给药14 d后进行运动能力及嗅觉功能的行为学检测。

转棒实验(rotarod test)：将小鼠从清洁级动物房转移到动物实验操作间，放置60 min让小鼠适应环境。打开转棒装置，将旋转杠的速度调节到20 r/min。然后将小鼠放置在旋转杆上，小鼠从旋转杆上掉落的时间即为潜伏期，记录该时间。并且设定最长的潜伏期为300 s。在计算时取3次测试的平均数。测试完小鼠后将其转移到清洁级动物房，并且用70%的酒精擦干净转棒装置。埋藏饼干实验(Buried pellet test)：一个干净的笼盒(45 cm×24 cm×20 cm)，然后将干净的垫料均匀的铺在笼盒的上面，大约 3 cm厚。再将实验用饼干埋藏在垫料之下，大约0.5 cm，使饼干完全看不见。将小鼠放在实验笼盒中的正中央，按下计时器开始计时。当小鼠找到饼干并且开始吃的时候按下计时器停止计时，这段时间则是小鼠寻找饼干的时间，记录此数据用于统计分析。若小鼠在300 s内都没有找到饼干，则停止计时，并记下时间300 s。木块实验(Block test)：准备好实验用木块(2 cm×2 cm×2 cm)，分别装在各自的袋子中，每个袋子只能装一个木块，然后从每笼小鼠的笼盒中分别取出8 g的垫料填满各自的袋子中室温过夜。在实验区域放上两个木块，一个木块带有接受测试小鼠自身笼盒垫料的气味；另一个则是带有不同气味的木块。将小鼠放在实验笼盒中的正中央，按下计时器开始2 min的录像。观看录像，分别数出小鼠嗅带有自身笼盒垫料气味的木块时间(own scent)，和嗅带有不同气味垫料的木块时间(novel scent)，用novel scent/own scent的比值作为数据进行统计分析。

1.3 动物取材 动物经生理盐水和4%多聚甲醛灌流固定后，取嗅球在多聚甲醛中固定1 d，再移入5%、85%、95%、100%、100%酒精，由低浓度到高浓度脱水。然后将组织放入二甲苯中脱水，最后用石蜡包埋，切取4 μm厚的冠状平面的片子。

1.4 免疫组织化学技术 二甲苯脱蜡两次，每次10 min。再用酒精梯度水化，依次为100%、100%、95%、85%、75%，水化时间分别是10 min、10 min、5 min、5 min、5 min。用PBS漂洗3次，每次5 min，再将玻片放置在柠檬酸缓冲液中微波抗原修复95 ℃～98 ℃，保持时间为20 min。自然冷却切片，用PBS漂洗3次，每次5 min。使用3%过氧化氢阻断过氧化物酶的作用，孵育时间15 min。之后先用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl一抗于组织上，放在4 ℃冰箱中。第2天，取出切片。用PBS 漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB试剂盒中的A液，在室温下孵育60 min。孵育完成后，用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB试剂盒中的显色液，室温显色2～3 min。使用苏木精染核数秒至十几秒，流水冲洗30 min。酒精梯度脱水，从低浓度到高浓度，依次为75%、85%、95%、100%、100%;水化时间分别是5 min、5 min、5 min、10 min、10 min。再用二甲苯通透两次，每次10 min。最后用中性塑胶封片。

1.5 免疫印迹技术 使用12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。使用恒定电压进行电泳，当样品在浓缩胶的时候使用的电压一般为80～90 V，当样品在浓缩胶的时候使用的电压一般为100～120 V。电泳结束后准备转膜。把转膜槽放在低温环境中330 mA转膜90～120 min。转膜之后用 PBST 洗3×5 min。再放入到5%的脱脂牛奶中封闭1 h。然后敷一抗TH (1∶500)、β-actin(1∶5000)，在4 ℃过夜。第2天，在室温下用PBST 洗膜，3×10 min。加入与一抗所相对应的二抗(1∶2000)，在室温下充分孵育2～3 h，再用PBST洗膜，3×10 min，室温。最后将ECL底物显色A、B 液以1∶1混合，加到膜的表面，反应1 min。把膜放在凝胶电泳仪上成像，适当调整曝光时间。得到所需蛋白的荧光成像图。

1.6 细胞计数 TH阳性细胞的计数在光镜下分析，阳性细胞为细胞浆染成棕褐色。每个样本从中挑取3～4片计数，取其平均值。

2 结 果

2.1 行为学结果 实验第14天进行行为学观察，MPTP组小鼠出现明显的行为学障碍。MPTP小鼠的运动能力显著下降(见图1A)。MPTP小鼠的嗅觉察觉和分辨能力也都发生了明显的下降(见图1B、图1C)，各组小鼠n=6。

图1 行为学观察MPTP组小鼠出现明显的行为学障碍。图1A显示MPTP小鼠的运动能力显著下降;图1B和图1C分别显示MPTP小鼠的嗅觉察觉和分辨能力也都发生了明显的下降；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs 相应的对照组，数据以表示(n=6)

2.2 TH阳性神经元在嗅球中的表达 我们利用免疫组化实验直观的观察了嗅球中DA能神经元数量的变化。显示的是对照组和MPTP组小鼠嗅球中的TH阳性神经元(见图2A、图2B)。两组小鼠嗅球中DA能神经元数量的统计(见图2C)，各组小鼠n=3。

图2 免疫组化实验观察嗅球中DA能神经元数量的变化。如图2A和图2B分别显示的是对照组和MPTP组小鼠嗅球中的TH阳性神经元;图1C则是对两组小鼠嗅球中DA能神经元数量的统计，MPTP小鼠模型嗅球部DA能神经数较生理盐水组显著增多；*P<0.05 vs 相应的对照组，数据以表示(n=3)

2.3 MPTP组小鼠嗅球中的TH蛋白水平升高 我们用免疫印迹的方法进一步验证了MPTP组小鼠嗅球中的TH蛋白表达水平也是升高的(见图3)，各组小鼠n=3。

图3 免疫印迹的方法检测MPTP组小鼠嗅球中的TH蛋白表达水平。如图3A、3B。MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表达较生理盐水组显著增多(P<0.05)；*P<0.05 vs 相应的对照组，数据以表示(n=3)

3 讨 论

帕金森病是一种临床上常见的进行性中枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，致纹状体DA含量下降[8]。以往研究表明，在帕金森病的非运动症状中嗅觉障碍发病率极高，嗅觉功能障碍是帕金森病的一个早期、常见的特征，通常发生在运动症状之前数月甚至数年[9]。PD的嗅觉障碍主要表现在气味识别、气味辨别、气味记忆等各个方面，但在不同的PD患者中又存在着差异[10]。嗅觉障碍与PD的疾病进展和疾病严重性分级有关，其中气味辨别能力高低也与PD的严重程度相关，嗅球是嗅觉通路的重要枢纽，DA作为一种神经递质，除了广泛存在于黑质-纹状体系统中，在嗅球等其他部位也有分布[11,12]，这就提示帕金森病可能存在嗅球多巴胺能神经元的异常。

目前帕金森病并发嗅觉障碍的发病机制尚不清楚。Galvi[13]通过行为学等检测方法对帕金森病患者的嗅觉功能进行测定，认为患者嗅觉功能的减退与其认知功能有关。既往研究显示，早期帕金森病患者嗅球内小球周细胞中TH阳性细胞数量约为正常对照组的两倍，提示早期帕金森病患者嗅觉丧失可能与嗅球代偿性DA增加有关。但随着疾病的进展，代偿效应消失后嗅球DA神经元数量逐渐减少[14,15]。同样类似的报道出现在MPTP诱导的灵长动物模[12]。此外,有研究表明嗅球中多巴胺表达量的显著升高也有可能是其针对黑质中多巴胺能神经元丢失后的一个快速代偿反应，在纹状体也有类似的代偿反应[16,17]。这个也可以解释左旋多巴治疗后并没有改善PD患者嗅觉障碍的原因。研究发现侧脑室室管膜下区(SVZ)是神经再生发生的主要区域之一,产生新的神经元和神经胶质细胞通过嘴侧迁移流(RMS)通路运输至嗅球进而对嗅觉损伤部分进行修复。据报道，纹状体多巴胺能去神经化后SVZ增殖减少，嗅球中多巴胺神经元数量代偿性增加[18]。综合以上所述我们可以认为嗅球部神经元数目及递质改变可能与嗅觉障碍有关系，故需要实验研究来进一步证实。

建立理想的模型对于探索发病机制、寻求药物治疗是极为重要的。MPTP小鼠模型是目前应用最广泛的PD模型,以往的研究已证实MPTP 小鼠模型在组织化学和生物化学上均符合临床 PD的特征,是一种较理想的PD模型[19]。在本次实验中我们利用木块实验来考察小鼠对气味辨别的能力。我们发现与MPTP组小鼠相比，生理盐水对照组小鼠明显更加喜爱去嗅沾染了不同于自己笼盒内垫料气味的木块，即这些小鼠具有较强的嗅觉分辨能力。同样我们采用了一种十分普遍且简单的方法，即埋藏饼干实验来检测小鼠的嗅觉察觉能力。我们的结果显示MPTP组的小鼠需要比对照组花费更多的时间来寻找埋藏的饼干，这表明MPTP小鼠嗅觉察觉阈值升高了。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是多巴胺合成的限速酶,可作为多巴胺能神经元的标志,我们对TH+细胞的检测能直接反映出DA能细胞数量。我们用免疫荧光标志出TH阳性细胞数表示多巴胺能神经元，发现MPTP小鼠模型嗅球部DA能神经数较生理盐水组显著增多(P<0.05)，有统计学意义。同时我们免疫印迹检测TH蛋白发现MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表达较生理盐水组显著增多(P<0.05)，有统计学意义。可见帕金森病小鼠嗅觉障碍与嗅球部DA能细胞增加有关，为帕金森病并发嗅觉功能障碍提供了佐证。但嗅觉系统是疾病发生和发展的重要途径道，同时也是治疗干预的早期和可达窗口。未来我们可以进一步研究帕金森病小鼠嗅觉障碍是通过什么机制上调TH蛋白的表达，为寻求有效的药物治疗提供帮助。