一株野生黑木耳菌株的鉴定及其栽培特性研究

刘岩岩 张 敏 李 红 刘俊杰

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳110161）

黑木耳又称木耳、光木耳、云耳、树耳、木娥等，真菌学分类中属担子菌门、银耳目、木耳科[1]。黑木耳是我国传统的出口商品之一，目前我国的黑木耳年产量占全球产量的90%以上。辽宁省是仅次于黑龙江、吉林的黑木耳生产大省，栽培品种黑29、8808、黑威系列、新科等多为野生种质直接驯化而来，杂交品种的亲本大多也是野生种质。野生黑木耳具有分布广泛、适应性强和抗性强等特点。野生黑木耳主要分布在黑龙江大兴安岭、小兴安岭，吉林长白山，辽宁东部山区，广西的桂西、桂西北地区、陕西大巴山和秦岭山脉、四川东部、西藏、新疆等地[2-3]，其经过长期的进化和演变积累了丰富的遗传资源，遗传多样性好，弥补了栽培种质遗传背景单一的缺陷。黑木耳野生菌株的驯化，为黑木耳品种选育、复壮、改良提供了有效的生物资源，同时也为增加黑木耳的遗传多样性和创造新物种提供了可能[4]。

传统的真菌分类主要按照真菌的子实体的形态、颜色、气味以及孢子特征等。形态特征不仅容易受到生长环境的影响而表现出较大的差异，而且形态特征是易变的、模糊的，同时真菌的种类众多，个体多态性强，因此传统的分类学指标常常会得到错误的结果。相反，以DNA 核苷酸序列为基础的基因型则相对稳定，不易受环境影响，而且在生活史任何阶段均可获得，因而以DNA 分子序列进行种类鉴定其结果更加准确可靠[5]。rDNA 内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）位于核糖体 rDNA中，包括18S 和28S 基因之间的区域片段，由于ITS区域片段较小，长度一般为650～750 bp，易于分析，是中度保守的序列，其表现为种内相对一致，种间具有高度特异性，且含有大量的通用引物。这些特征使ITS 在真菌物种的分类鉴定以及系统发育研究应用最为广泛。因此笔者也用ITS 对黑木耳野生菌株进行鉴定，为黑木耳的驯化栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生黑木耳菌株，来自辽宁省本溪市东营坊乡老边沟风景区。对照菌株为：黑29、纯黑山、黑威15，为辽宁省农业科学院食用菌研究所保存。

1.2 供试培养基

①综合马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO42 g，KH2PO41.5 g，琼脂18 g，自来水定容至1 000 mL，pH 自然。用于野生菌株的分离、鉴定及分离菌株母种的制备。②栽培料：木屑85.5%，麸皮10%，豆饼粉2%，石膏1%，石灰1.2%，磷酸二氢钾0.3%，料含水量65%。用于分离菌株原种及栽培种的制备。

1.3 子实体形态观察

取子实体完整部分，观察并描述其表面性状、结构、颜色，并进行形态学特征初步鉴定。

1.4 野生菌株的分离及菌种的制备

用75%酒精棉球擦拭干耳片表面2～3 遍，将耳片四周边缘剪去后，剪取远离耳基最平整部位的耳片0.5 cm×0.2 cm，用镊子夹取该组织块在酒精灯火焰外焰上方来回快速穿梭2～3 次（每次1～2 s）后，插入PDA 斜面培养基中。23 ℃避光培养，待长出菌丝后转入空白PDA 斜面培养基上纯化培养，获得一级菌种即母种。

1.5 ITS测序及分析

1.5.1 DNA提取

取新鲜菌丝体0.3 g 左右，低温充分研磨后，采用E.Z.N.A.Fungal DNA Kit 试剂盒提取总DNA，提取物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，分装后，于-20 ℃条件下保存[6]。

1.5.2 PCR扩增

采用真菌通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGT⁃GAACCTGCGG-3' 和 ITS4：5'- TCCTCCGCTTATT⁃GATATGC-3'）进行扩增。扩增体系：总体积20 μL，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。

PCR 扩增反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，30 个循环，72 ℃延伸7 min。PCR 反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送检目的条带进行测序。测序公司：北京诺赛基因组研究中心有限公司，Sanger测序，双向测序。将测序获得的序列通过NCBI 进行Blast 比对分析，分析同源性[7]。

1.5.3 系统进化分析

应用Mega 6.0 软件，以Gene bank 中银耳科盘革耳属（Eichleriella deglubens）ITS 序列为聚类外群，bootstrap 次数 1 000，采用最大似然法（Maximum likelihood methods，ML）构建系统发育树。

1.6 拮抗试验

把分离菌株与主栽菌株进行拮抗试验，3 个一组进行组合，每个菌种用直径0.5 cm 的打孔器打取3 个菌丝块，交叉循环，设置3 个重复。每个平皿接种3 个菌株，按“品”字形排列。菌丝块间距3 cm 左右，置于23 ℃，黑暗条件培养。观察分离菌株与主栽菌株间拮抗线状态，分析相互间亲缘关系远近。

1.7 菌丝培养特性研究

1.7.1 母种培养阶段菌丝生长情况

将供试的菌株分别接到PDA 平板（直径9 cm）培养基上，23 ℃避光培养，每天测定并记录菌丝生长速度及长势。

1.7.2 原种培养阶段菌丝生长情况

将供试菌株母种接到原种培养基上，容器规格为500 mL 罐头瓶。每个菌株100 瓶，23 ℃避光培养，每天测定并记录菌丝定植及生长情况。

1.7.3 栽培种培养阶段菌丝生长情况

将供试菌株原种接到栽培种培养基上，容器规格为17 cm×33 cm聚乙烯塑料袋。每个菌株200袋，23 ℃避光培养，每天测定并记录菌丝定植及生长情况。

1.8 栽培特性研究

经过后熟期的栽培种菌袋，采用露地全光标准栽培模式管理，定时扎眼、催芽。观察记录催芽情况、污染袋数、满袋时间、子实体性状及产量等。

2 结果与分析

2.1 子实体形态特征

野生黑木耳菌株耳片深黑色，大部分耳状，厚度0.7 cm 左右，边缘圆正，少筋或无筋，干耳背面有纤毛，颜色灰白，稀疏。

图1 野生黑木耳生态照

2.2 ITS序列扩增

采用通用引物ITS1/ITS4进行序列扩增，均得到清晰的大小约为600 bp 的特异性条带，这与Gen⁃Bank 中所报道的黑木耳ITS 序列长度基本一致，可以进一步用于测序[8]。

图2 ITS-PCR琼脂糖电泳

2.3 系统进化分析

从聚类图（图3）可见，野生菌株 M 与LC373472.1（Auricularia villosula）的序列同源性较高，达100%。鉴定野生菌株为木耳属[7]，黑木耳种。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树

2.4 拮抗试验

由表1 可以看出，野生黑木耳菌株与对照菌株均有明显的拮抗线，说明野生黑木耳菌株与本地主栽菌株亲缘关系较远，排除菌种漂移的可能性，是新的种质资源。

表1 拮抗试验结果

图4 供试黑木耳菌株拮抗状态

2.5 菌丝培养特性研究

2.5.1 母种培养阶段菌丝生长情况

由表2可以看出，野生黑木耳菌株菌丝浓白，菌落边缘整齐，无色素分泌，菌丝生长速度与其他三个主栽菌株无明显差异。

表2 供试菌株在母种培养阶段菌丝生长情况

2.5.2 原种培养阶段菌丝生长情况

由表3可以看出，野生黑木耳菌株菌丝洁白，长势浓密、粗壮，定植快，污染率较低，抗性强，菌丝生长速度与其他三个主栽菌株无明显差异。

表3 供试菌株在原种培养阶段菌丝生长情况

2.5.3 栽培种培养阶段菌丝生长情况

由表4可以看出，野生黑木耳菌株菌丝洁白，长势浓密、粗壮，定植快，污染率较低，抗性强，菌丝生长速度明显快于黑威15，与其他两个主栽菌株无明显差异。

表4 供试菌株的栽培种培养阶段菌丝生长情况

2.5.4 栽培特性研究

由表5可以看出，野生黑木耳菌株现耳时间短，出芽率较高，耳片单生，边缘圆正，耳片厚，颜色深，产量高等优良栽培性状，为黑木耳品种选育、复壮、改良提供了新的种质资源。

表5 供试菌株子实体的生长发育情况

3 小结

运用ITS 分子标记，成功地对一株野生黑木耳进行鉴定，确定该野生菌株为木耳属，黑木耳种，说明ITS 技术可以用来进行黑木耳的种类鉴定。经过鉴定的野生黑木耳菌株人工栽培获得成功。研究为黑木耳品种选育、复壮、改良提供了新的种质资源[9]。