肝移植肠道微生态研究进展

孙纪三 谢炎 罗宇涵 蒋文涛

肝移植是目前治疗各类型终末期肝病的唯一有效方法。术后感染、急慢性排斥反应、胆道狭窄等并发症严重影响病人手术预后。肠道微生态包括肠道菌群及菌群生活的环境，是人体最大的器官，其细菌总数超过1014，它参与人体免疫、代谢等多项功能。在肝移植人群中，由于肝病本身及肝移植手术的影响，肠道微生态会发生改变。这种改变与术后感染、排斥反应等存在着密切联系，既可以作为某些并发症的敏感标志物预测并发症风险，又可以作为治疗靶点帮助减少或减轻并发症[1]。肠道稳态失调还可造成缺血性胆道并发症，它是肝移植术后最严重的并发症，病情迁延反复，最终可发展为移植物失功，病人被迫接受二次移植。在肝移植围术期的管理中，肠道微生态的作用不可忽视。本文拟从肠道微生态出发，分析总结肝移植与肠道微生态之间的联系，为未来肝移植术后肠道微生态的临床治疗提供参考。

一、肝移植围手术期肠道微生态

1.肝脏疾病与肠道微生态：肠上皮细胞是肠道的免疫基础，在酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)人群中，由于长期摄入大量酒精，酒精及其代谢产物可改变肠道菌群结构，破坏肠道屏障功能，导致肠道发生慢性炎性反应[2]。在动物实验中，采用酒精诱导的ALD小鼠肠道中厚壁菌属/拟杆菌属比值显著下降[3]。酒精暴露还会促进细菌移位，影响免疫系统对肠-肝循环体系中有害物质的清除能力。在非酒精性肝病(non-alcoholic liver disease，NAFLD)人群中，肥胖病人肠道菌群与正常人有所不同。动物实验表明,将高脂饲料组小鼠肠道菌群移植到正常小鼠后，正常小鼠体重明显增加，说明肠道菌群在代谢相关疾病中发挥重要作用[4]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生与肠道菌群之间也存在联系。肠道菌群的次生产物可以与Toll样受体结合，引起炎性反应从而促进肿瘤发生[5]。有研究表明，使用抗生素干扰小鼠肠道菌群，通过消耗肠道共生细菌，阻止初级胆汁酸转化，上调肝脏中某些初级胆汁酸，进而产生天然杀伤性T细胞的蓄积，可使正常组织免受肿瘤侵犯[6]。Th17细胞能促进部分肿瘤的发生，肠道菌群与其所分泌的IL-17存在一定关系。有研究表明，通过改变肠道菌群可以下调IL-17，改变肿瘤生长的微环境，促进肿瘤细胞的凋亡[7]。这些研究都为肠道菌群与肿瘤发生发展间的联系提供了参考。

2.肝移植手术与肠道微生态：肝脏70%的血供来自门静脉，门静脉血流很大一部分来自结肠。因此，肝脏容易暴露在肠源性抗原刺激之下，它是抵挡肠源性抗原的防线[8]。肝移植手术与肠道菌群失调、移位密切相关。越来越多的动物实验与临床试验结果表明，在肝移植手术前后，实验动物或临床病人肠道微生态结构、肠道菌群数目均发生明显改变。在大鼠原位肝移植模型中，与非手术组相比，实验组在肝移植术后24小时发生了明显的肠道菌群紊乱，表现为肠杆菌和肠球菌数量增加，乳酸杆菌和双歧杆菌数量下降，肠黏膜上皮细胞微绒毛损伤，血浆内毒素水平升高，细菌易位至肝脏、脾脏及肠系膜淋巴结。术后1个月使用变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)法检测肠道菌群，这些改变仍不能恢复至正常水平[9]。临床研究中也有类似发现，移植术后病人粪便中，双歧杆菌、柔嫩梭菌及乳酸杆菌数量下降，肠杆菌及肠球菌数量增加，并随着手术后时间推移，菌群结构与菌群数量会逐步缓慢恢复至正常[10]。总体来说，肝移植术后肠道微生态的多样性会被破坏，造成某些肠道菌群及其分泌物的缺乏，不利于术后恢复。

二、肠道微生态对肝移植术后恢复的影响

正常的肠道微生态有利于肝移植病人术后恢复。肠道微生态失衡则会导致一系列术后并发症以及移植肝功能延迟恢复。

1.肠道微生态与胆道并发症：肠道微生态失衡易引起胆道并发症，以缺血性胆道病(ischemic type biliary lesion，ITBL)最为常见。ITBL又称非吻合口胆道狭窄，是肝移植术后最严重的并发症之一，表现为胆汁淤积和胆道感染，严重影响手术预后。病人常需反复住院治疗，移植肝功能持续恶化，部分病人难以避免接受再次移植。研究表明，缺血再灌注损伤、免疫因素和胆汁酸均与ITBL的发生有关，而肠道微生态与这三者均存在联系。肠道微生态与胆汁酸之间存在“肠-肝轴”的关系。一方面，肠道菌群可以调节胆汁酸代谢稳态；另一方面，胆汁酸也可以影响肠道微生态构成。初级胆汁酸进入肠道后，需要在肠道多种细菌分泌的酶的作用下解离、脱羟基、异构化、氧化来增加胆汁酸的亲水性，使其不会通过疏水的肠道上皮丢失。同时，初级胆汁酸向次级胆汁酸转化过程所需要的7α-脱羟基酶也由肠道细菌分泌产生[11]。一项临床横断面研究发现，肝硬化病人的初级胆汁酸水平和肠杆菌数量均显著增加，而产生7α-脱羟基的细菌均减少[12]。总之，肠道微生态与胆汁酸之间存在相互作用，肠道菌群失调可影响正常胆汁酸代谢过程，胆汁酸代谢紊乱也会反过来导致肠道微生态失衡，而肠道菌群改变是导致ITBL的重要因素。

2.肠道微生态与术后感染：肝移植围手术期肠道微生态发生变化，可导致肠道菌群多样性下降，失去其正常屏障功能，一些本不该出现的肠道菌群大量繁殖，增加了移植术后病人的感染风险。一项回顾性临床研究显示，通过比较分析肝移植病人术前和术后1个月内肠道菌群变化，发现肠道菌群多样性降低与术后感染并发症密切相关[13]。PCR-DGGE检测病人粪便发现，术后住院时间较短的病人的肠道菌群仅有轻微变化。此外，在2例术后腹腔感染的病人粪便中还发现了齿双歧杆菌，这是一种主要存在于口腔的定植菌，只有在病理状态下才会在肠道中出现。肝移植手术会造成肠道菌群移位。一项研究通过脉冲场凝胶电泳技术(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析肝移植受者术后15天的肠道菌群发现，未进行肠道微生态干预的病人肠道菌群移位发生率为32%，其中腹腔感染6例，口服乳酸菌和双歧杆菌治疗的干预组肠道菌群移位发生率为8%，其中腹腔感染1例，可见肠道微生态与肝移植术后腹腔感染相关，微生态调节治疗可有效降低感染发生率[14]。

3.肠道微生态与免疫排斥：肝移植术后排斥反应与免疫系统密切相关，多由T细胞介导产生。有研究显示，肠内乳酸菌和双歧杆菌可以减轻急性排斥反应中的免疫损伤，这可能是由于肠道益生菌对T细胞 、转化生长因子-β及CD4/CD8比例的影响造成的[15]。还有研究证实肠道菌群能够促进T细胞分化，调节自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NK-T)和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的发育成熟过程，而NK-T细胞、NK细胞均与移植术后的免疫排斥相关[16]。大量研究已证实，肝移植术后病人肠道菌群改变与急性排斥反应的发生有关。动物实验中也有类似发现，发生急性排斥反应的肝移植大鼠，其肠道菌群特点为拟杆菌属和瘤胃球菌属过度增殖，这种改变可能是由血清内毒素水平升高和肠道菌群移位造成的。Ren等[17]研究肝移植大鼠回盲肠内容物后发现，急性排斥反应发生时微生物数量及多样性均下降，其中厚壁菌门减少，而拟杆菌门增加。肝功能尚正常时急性排斥反应可能已经发生，此时肠道菌群与急性排斥反应进展期相似，检测肠道菌群改变可能比肝功能指标能更早地提示急性排斥反应。

4.肠道微生态与缺血再灌注损伤：肠道微生态改变还可能与术后肠道和移植肝的缺血再灌注损伤有关。研究发现，小鼠肠道细菌能通过释放一系列小分子物质至循环系统，上调肝窦内皮细胞细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达，从而提高离体肝脏对冷保存和缺血再灌注损伤的敏感性[18]。另一项研究表明，在大鼠肝移植前对移植肝进行缺血预处理可以保护受体大鼠的肠道菌群，预处理后肝移植大鼠术后的肠道菌群与未移植大鼠的肠道菌群相似，而直接行肝移植的大鼠肠道菌群会显著改变，证明了移植肝缺血预处理对正常肠道菌群的保护价值，也证明了肠道菌群与缺血再灌注损伤之间的联系[19]。另外，在小鼠研究中发现，通过限时喂养(time-restricted feeding，TRF)，即每天动物禁食14～16小时，可以在满足营养的同时通过影响肠道微生态达到减轻肝缺血再灌注损伤的目的[19]。与正常进食小鼠相比，TRF小鼠的肠道菌群与上皮连接更为紧密，减少了细菌移位，且术后肝功能恢复更迅速。一项临床研究发现，在肝移植术后应用利福昔明可以通过调节肠道菌群来减轻肝缺血再灌注损伤[20]。使用利福昔明的病人术后血清转氨酶水平恢复更快，术后肝活检巨噬细胞标志物、中性粒细胞标志物的表达也较低，这些都表明肝缺血再灌注损伤更轻。肠道微生态的稳定可以通过抑制移植物中的炎症细胞活化而发挥对肝缺血再灌注损伤的保护功能。

三、 肠道微生态治疗的可行性与展望

肠道微生态的重要性已经被越来越多的专家学者证实。人们逐渐将肠道微生物作为治疗靶点，通过改善肝移植后肠道微生态失衡，促进肠道环境恢复正常，将有助于减少和治疗术后并发症，这类疗法统称为肠道菌群干预。目前，如何通过肠道微生态治疗来促进肝移植术后恢复仍处在探索阶段。应用最广泛的是直接影响肠道菌群的抗生素和益生菌。此外，肠道去污染，术前肠道缺血预处理，粪便菌群移植等方案也有研究报道。

1.抗生素与肠道去污染：在肝移植术后恢复阶段，由于手术原因和免疫抑制剂的使用，病人感染的风险较高。选择性肠道去污染(selective decontamination of digestive tract，SDD)是指应用抗生素杀灭肠道内的机会致病菌，保留肠道原有专性厌氧菌，减少细菌移位和肠源性感染的发生几率。早期研究发现，SDD能够减少肠道中革兰阴性需氧菌及假丝酵母菌(念珠菌)的数量，降低相应感染并发症。然而，有研究发现在革兰阴性菌被杀灭后，革兰阳性菌则成为优势菌群，并导致感染发生。另一后续研究显示，SDD不能降低原位肝移植术后感染的发生率，仅仅改变了感染的分布类型，革兰阳性球菌感染替代了原来占主导地位的杆菌及假丝酵母菌感染。另外，SDD增加了原有细菌的耐药性，导致治疗感染时需要更大的抗生素使用量，并且延长了住院时间[21]。尽管抗生素治疗是肝移植术后不可或缺的一环，但目前大部分观点认为，肝移植术后为了减少肠道感染而人为进行SDD并不可取。然而，一项荟萃分析显示，SDD降低了肝移植后肺炎的发生率[22]。

2.益生菌与益生元：使用益生菌和益生元来调节肠道微生态也是目前较热门的辅助治疗。一般情况下，肝移植术后肠道乳酸菌和双歧杆菌数量会减少。在动物实验中，大鼠肝移植后补充乳酸菌和双歧杆菌，能够改善肠道屏障功能并减少细菌移位，促进肠道菌群的恢复，并且乳酸菌和双歧杆菌可以减轻大鼠在急性排斥反应中的排斥损伤，这可能是由于肠道益生菌对T细胞、转化生长因子-β及CD4/CD8细胞比例具有调节作用所致[23]。临床荟萃分析显示，肝移植术前或手术当天给予益生菌能够减少肝移植术后感染发生率、抗生素使用疗程及住院时间[24]。有报道就肠道益生菌的使用做出总结，肝移植术后24小时内开始早期肠内营养，起始鼻饲速度每小时20 ml，联合使用乳酸杆菌属20 mg、双歧杆菌属15 mg，每天3次；鼻饲尽早转换为经口进食，持续至少14天[25]。但目前国内报道仍较少，该标准仅供参考。

3.缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)：IPC是指在手术前对靶器官进行短暂反复的缺血再灌注处理，在不伤害身体的同时诱导产生保护机制，从而减轻正式手术时器官对缺血再灌注损伤的敏感程度。有研究发现，在肝移植术前进行IPC可以改善肝移植术后移植物功能，降低ALT、AST水平[26]。经过IPC处理后，术后的肠黏膜超微结构较对照组改善，血清内毒素降低，细菌移位减少，粪便sIgA含量增加，血清TNF-α降低。此外，IPC可以通过增加双歧杆菌属，梭状芽孢杆菌簇来促进肠道微生物结构和数量的恢复。经PCR-DGGE法证实，IPC增加或保留了肠道微生物的多样性和丰富度。IPC不仅可以促进移植肝功能恢复和保留肠屏障功能，还可以促进肝移植术后肠道菌群恢复，充分发挥“肠-肝轴”的正反馈作用。目前该方法在临床肝移植中报道较少。

4.粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，FMT)：FMT是将正常人的粪便直接移植到病人肠道内，帮助病人快速恢复肠道正常菌群的方法。既往FMT常用于各种肠炎和肠道感染的治疗，也取得了一定的效果。如在艰难梭菌感染(clostridium difficile infection，CDI)的治疗中，FMT较传统抗生素治疗效果更佳[27]。1次FMT后疗效可维持24周，较益生菌更为持久。然而，关于FMT的伦理问题和安全问题一直存在争议，目前也没有规范化的FMT标准。目前FMT在临床肝移植中尚未见报道。粪便获取简便快捷，且具有代替部分抗生素治疗的作用，其在肠道菌群治疗中的前景不容忽视。

四、小结

随着PCR-DGGE等技术的发展，肠道菌群的实时监测成为可能，人们开始致力于研究肠道微生态与各种疾病之间的联系。在肝移植领域中，越来越多的研究开始关注病人围手术期肠道微生态的变化，并发现肝病本身和移植手术造成的缺血再灌注损伤都会改变肠道菌群的分布。在围手术期，肠道菌群状态对肝移植术后并发症的发生具有重要影响，它与胆道并发症、缺血再灌注损伤、感染、排斥反应等关系密切。肠道菌群及其分泌物在胆汁酸生成的“肠-肝循环”和免疫调节中起重要作用。肝移植围手术期合理使用抗生素、益生菌调节肠道菌群，维持肠道细菌稳态，可促进肠道微生态恢复正常，进而预防肝移植术后并发症，改善病人预后。在肝移植病人中使用SDD、FMT和IPC治疗仍存在争议。肠道微生态的研究和应用前景广阔，期待随着研究的深入使得肠道微生态治疗成为一种常规治疗手段，改善肝移植病人预后。