从HBV特异性免疫细胞角度谈慢性乙型肝炎功能性治愈

刘小菊， 张 政

1国家感染性疾病临床医学研究中心(深圳市第三人民医院)， 广东 深圳 518112；2南方医科大学南方医院 感染科， 广州 510515

目前，全球约有2.57亿慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病[1]。极少数的CHB患者可以通过抗病毒治疗实现功能性治愈，即完成有限疗程治疗后，血清HBsAg和HBV DNA持续检测不到、HBeAg转阴、伴或不伴HBsAg血清学转换，肝脏炎症缓解和组织病理学改善，终末期肝病发生率显著降低[2]。多数CHB患者需要进行长期甚至终身治疗，这无疑给患者和卫生系统带来巨大挑战。CHB患者实现功能性治愈代表患者获得了持久的病毒学抑制和免疫学控制。长期应用一线抗病毒药物如PEG-IFNα、核苷(酸)类似物(如替诺福韦或恩替卡韦)等可以实现病毒学抑制，但难以实现功能性治愈[3]。目前报道的抗病毒策略，包括病毒进入抑制剂、病毒衣壳释放抑制剂、免疫调节剂或治疗性疫苗，都未能实现更多功能性治愈；其主要原因是肝细胞内仍然残留HBV cccDNA，且目前缺乏针对HBV cccDNA的特异性靶向药物，完全消除HBV难以实现[4]。HBV建立慢性感染后，长期持续刺激宿主免疫细胞，肝脏微环境中特异淋巴细胞(CD8 T淋巴细胞和B淋巴细胞)功能被抑制甚至耗竭[5-7]。HBV清除取决于有效的适应性免疫应答，即HBV特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞，发挥靶向抑制感染HBV的肝细胞和(或)病毒的效应。本文从特异性免疫细胞角度出发，对HBV特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞耗竭及功能重建策略进行总结，为恢复或增强抗HBV适应性免疫提供线索，以实现对HBV的持续免疫学控制。

1 HBV特异性T淋巴细胞耗竭及功能重建

急性自限性HBV感染多表现为强烈的、多表位、多功能性的特异性T淋巴细胞反应；然而慢性感染中，HBV特异性T淋巴细胞反应较弱且功能不足[8]。研究[9-10]发现，肝脏的环境特征，包括肝细胞和肝脏归巢细胞的耐受性以及慢性HBV感染者肝内富集的IL-10、TGFβ和精氨酸酶等，均对T淋巴细胞功能具有不良影响。CHB患者HBV特异性T淋巴细胞并非完全功能耗竭。在低病毒载量患者中，HBV特异性T淋巴细胞可表现出记忆样表型，推测可能与接受较弱的HBV抗原持续刺激有关。PD-1等共抑制分子在调节T淋巴细胞效应作用以及T淋巴细胞衰竭中起着核心作用。HBV特异性T淋巴细胞上PD-1的表达，不仅取决于感染的阶段，还取决于靶向的HBV表位。不同表位的HBV特异性CD8 T淋巴细胞在细胞分化、调节分子的表达和抗病毒功能上也有所不同。与核心抗原(HBV-core)特异性CD8 T淋巴细胞相比，聚合酶(HBV-pol)特异性CD8 T淋巴细胞则表现出更严重的耗竭状态和更低的增殖能力。因此，不同感染阶段不同表位特异性T淋巴细胞具有不同的表型和功能特征[11-12]。在设计和监测HBV特异性T淋巴细胞反应时，必须考虑不同表位引起的潜在偏倚。而且不同表位HBV特异性T淋巴细胞具有不同的治疗潜力，并且会对PD-1阻断剂的免疫治疗产生不同的应答。

记忆CD8 T淋巴细胞库特异识别病毒后能够大量扩增，并显著抑制HBV[8]。逆转耗竭T淋巴细胞功能，可恢复对CHB患者的保护性免疫。额外添加细胞因子可挽救耗竭T淋巴细胞功能。例如，转录因子T-bet调节效应CD8 T淋巴细胞中IFNγ和细胞毒性分子的产生，其表达可控制病毒慢性感染。病毒抗原和IL-2刺激诱导T-bet表达可以部分恢复功能受损CD8 T淋巴细胞的功能。IL-12也可增强对病毒的控制，联合应用IL-12与阻断PD-1途径可进一步提高CD8 T淋巴细胞功能[13]。IL-21也具有促进HBV特异性CD8 T淋巴细胞的增殖能力[14]。

研究[15]还发现，HBeAg阴性患者在停止核苷(酸)类似物治疗后，HBV复发可能会改变特异性T淋巴细胞表型，并增强其体外对抗原的反应性；阻断PD-L1可以进一步增强这些HBV特异性T淋巴细胞反应。例如，一项停药研究[16]显示，长期抗病毒治疗的患者外周血HBV聚合酶/核心抗原特异性T淋巴细胞频率逐渐增加，并与停药后肝炎不复发相关；这也提示HBV特异性T淋巴细胞增高患者可以停止抗病毒治疗，为临床提供了一种潜在的免疫学标志。然而，与急性HBV感染者相比，长期治疗患者HBV特异性T淋巴细胞的抗病毒能力仍不健全，还需要其他措施来挽救其功能损伤。研究[17]发现，识别HBV表位的PD-1hiT淋巴细胞显著上调葡萄糖转运蛋白Glut1，Glut1hiHBV特异性T淋巴细胞依赖于葡萄糖供应。因此，细胞的线粒体功能障碍大大限制了耗竭的HBV特异性T淋巴细胞的代谢可塑性；用线粒体靶向的抗氧化剂有望改善耗竭的HBV特异性CD8 T淋巴细胞抗病毒功能[5]。

2 HBV特异性B淋巴细胞耗竭及功能重建

表面抗体的产生标志着CHB功能性治愈，此时CHB患者体内B淋巴细胞能够分化为浆细胞，产生针对一系列HBV抗原的多克隆抗体。很多研究[18]已经提示，B淋巴细胞在控制HBV感染中起着重要作用，但抗原特异性B淋巴细胞的检测一直是个技术难题，阻碍了HBV特异性B淋巴细胞功能的研究。

近期研究[7]显示，利用双荧光染料偶联病毒特异抗原的方法可检测到外周及组织中特异性B淋巴细胞。已经发现HBV表面抗原特异性B淋巴细胞在慢性HBV感染中持续存在，但与HBsAg滴度无显著相关性。这种细胞也存在于乙型肝炎疫苗接种者和HBV感染恢复者体内。利用高通量流式细胞分选技术可以从CHB患者中分离出HBsAg特异B淋巴细胞。体外实验提示，CHB患者HBsAg特异性B淋巴细胞增殖能力降低，且在刺激后不能产生抗-HBs。但HBsAg转阴患者，其HBsAg特异性B淋巴细胞却能在刺激后产生抗-HBs，提示其功能损伤获得恢复。进一步分析显示，CHB患者HBsAg特异B淋巴细胞和总B淋巴细胞中经典记忆性细胞亚群减少，而非经典记忆B淋巴细胞增加。这种非经典记忆B淋巴细胞主要特征是CD21和CD27低表达，但抑制性标志物PD-1和转录因子T-bet高表达；并且这类细胞在肝脏感染部位积聚，其抗病毒/炎症细胞因子产生等能力以及分化成抗体生成细胞的能力均显著降低。这种表型和功能障碍不仅局限于HBsAg特异性B淋巴细胞，还影响HBV感染者的整体B淋巴细胞群。阻断PD-1或添加IL-2、IL-21和CD40配体可在体外部分恢复HBsAg特异性B淋巴细胞功能[6-7,19]。因此，B淋巴细胞功能障碍是HBV感染者不能产生抗-HBs的主要原因之一。然而，还有许多问题悬而未决。例如，导致HBsAg特异性B淋巴细胞功能障碍的细胞和分子机制还不清楚，机体B淋巴细胞亚群受损机制和临床意义也不明确。未来研究应力图寻找恢复HBsAg特异性B淋巴细胞功能的最佳策略。

利用双荧光染料偶联的HBcAg同样可以检测到HBcAg特异性B淋巴细胞。研究[20]发现，CHB患者体内HBcAg特异性B淋巴细胞频率高于HBsAg特异性B淋巴细胞。并且，与HBsAg特异性B淋巴细胞不同，HBcAg特异性B淋巴细胞在体外可以有效分化为抗体分泌细胞。在慢性HBV感染者中，血清抗HBcAg水平与HBcAg特异性B淋巴细胞的数量和功能显著相关[20]。值得注意的是，HBcAg特异性B淋巴细胞除了产生抗-HBc外，可能还具有其他免疫调节作用。例如，抗-HBc可能会推动急性暴发性肝炎的发生发展；在肝脏中抗-HBc与HBcAg形成大颗粒抗原抗体复合物，可以激活经典的补体途径从而加重肝坏死[21]。因此，将来研究应进一步加强抗-HBc在CHB中的发病机理研究，以及HBcAg特异性B淋巴细胞抗体产生能力与功能性治愈的关系研究。

3 总结与展望

总之，从免疫学角度来看，实现CHB功能性治愈治疗HBV慢性感染的首要目标应该是恢复患者HBV特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量和功能。将来免疫治疗策略需要联合应用抗病毒药物，才能有效降低HBV抗原载量并恢复耗竭的抗HBV特异性免疫细胞功能。