免疫控制与慢性乙型肝炎功能性治愈的进展与挑战

郑 昕， 刘 嘉， 吴 珺， 孟忠吉， 陆蒙吉， 杨东亮

1 华中科技大学同济医学院附属协和医院 感染病科， 武汉 430022； 2 湖北医药学院附属太和医院 感染病科，湖北 十堰 442008； 3 德国杜伊斯堡-埃森大学医学院 病毒研究所， 德国 埃森 45122

乙型肝炎疫苗接种极大地控制了HBV的传播。但是，全球仍有约3亿慢性HBV感染者，持续性HBV感染所致肝硬化及肝癌等终末期肝病依然是人类健康的重大威胁之一。虽然IFNα与核苷(酸)类似物(NAs)已应用于慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治疗多年，并取得了巨大进步。但是IFNα仍存在副作用较大，抑制病毒复制作用有限，以及NAs需要长期服药，停药后易反弹，患者依从性不佳等问题[1-4]。

因此，在如何使得更多CHB患者实现功能性治愈方面仍存在巨大需求。需要在基础研究、抗病毒药物研发、个体化治疗预测和评估指标探索以及综合利用抗病毒与免疫调节药物开展功能性治愈新策略等方面深入研究。本期有幸邀请到国内长期从事CHB基础和临床研究，尤其是在HBV感染免疫方面多有深入探索的部分团队围绕HBV感染免疫控制与CHB功能性治愈研究进展以及各自工作体会进行了文献回顾和综述。相信将有助于加深对于该领域进展的了解。

1 HBV感染的免疫控制

HBV感染的结局可以表现为急性一过性感染或持续的慢性感染。虽然迄今对于其详细分子机制尚未完全阐明，但是已有的研究提示，HBV分子生物学特性、宿主的遗传及免疫学因素以及两者之间的相互作用是影响HBV感染结局的重要因素。当比较急性乙型肝炎和CHB的免疫特征时，人们普遍认为功能失调的免疫应答在持续性HBV感染和肝脏炎症中起着重要作用[5-8]。

已知HBV cccDNA在感染肝细胞的细胞核内以微染色体的形式持续稳定存在，难以被靶向调控和清除。围绕HBV cccDNA持续沉默或降解清除机制及策略的研究是当前CHB功能性治愈目标的重点之一[9]。本期复旦大学上海医学院袁正宏教授团队综述了目前对cccDNA基本生物学特性、转录和代谢调控机制及相关宿主因子的认知，重点分析了cccDNA沉默清除的可能途径和靶向调控策略。

慢性HBV感染的免疫应答特点包括：(1)HBV特异性CD4和CD8 T淋巴细胞功能障碍和衰竭；(2)树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞数量减少和功能障碍；(3)调控因子表达上调/增强，包括免疫检查点蛋白PD-1、CTLA-4、T淋巴细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域3；(4)先天免疫应答受损，尤其是Toll样受体(TLR)下调和功能障碍等[10-11]。本期华中科技大学同济医学院附属协和医院刘嘉教授团队就肝内固有抗原递呈细胞调控抗乙型肝炎免疫应答的作用及机制进行了介绍。陆军军医大学附属西南医院邓国宏教授团队结合自己的研究体会及同行近期研究结果就CHB患者的HBV特异性T淋巴细胞是否处于耗竭状态进行了深入讨论。

为了维持体内内环境平衡，肝内免疫系统优先诱导对从门静脉进入抗原的耐受。在持续性HBV感染中，肝脏中的抑制机制调节和抑制了T淋巴细胞的功能。研究发现，肝内炎症反应可在肝内原位诱导多条抑制通路，导致T淋巴细胞功能抑制。受损的肝细胞可释放精氨酸酶和吲哚胺2,3-双氧酶等，导致氨基酸的消耗，而氨基酸对维持T淋巴细胞功能非常重要。精氨酸损耗使得T淋巴细胞CD3ζ水平降低，进而导致T淋巴细胞受体-通路功能障碍。肝内炎症募集调节性T淋巴细胞、B淋巴细胞和髓系来源的抑制性细胞和活化的肝星状细胞，导致IL-10和TGFβ增加。虽然肝内抑制机制对于保护由炎症引起的严重损害至关重要，但是，也同时进一步损害了HBV特异性T淋巴细胞的功能[12]。

一般而言，高水平HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于维持针对HBV的特异性免疫耐受。因此，通过各种药物减少外周血和肝内的HBV颗粒和蛋白是重新建立有效的HBV特异性T淋巴细胞反应的先决条件。此外，人们发现，向CHB患者过继转移抗-HBs阳性者骨髓可以清除受者体内的HBV，以及通过肝移植将抗-HBs阳性供者免疫细胞转移到HBV感染受者体内能够部分控制移植肝脏的HBV再感染，这些均提示免疫调节是有望实现CHB功能性治愈的重要策略之一[13]。

2 CHB的功能性治愈策略

2.1 基于现有抗病毒药物的治疗策略 如前所述，目前用于CHB抗病毒治疗主要药物包括IFNα与NAs两大类，NAs主要以抑制病毒复制为主，但是HBsAg阴转率普遍不高；IFNα具有抗病毒与免疫调节双重作用，理论上讲应具有较高的HBsAg阴转率和血清学转换率，但无论是普通IFNα还是PEG-IFNα，治疗48周后总体HBsAg阴转率约3%。近十余年来，国内外研究表明，利用NAs与IFNα联合治疗有可能提高部分CHB患者HBsAg阴转率。具体方案包括起始联合、序贯/联合、中间联合以及脉冲(间断)联合等。治疗48周时HBsAg阴转率可提高到7.3%～26%，对于部分优势患者甚至更佳。提示NAs与IFNα联合治疗策略有利于发挥现有抗病毒药物的潜能，有助于更多患者实现功能性治愈的目标[14-17]。

2.2 基于免疫控制机制的治疗策略

2.2.1 临床研究 随着对HBV感染免疫控制机制认识的深入，人们意识到在有效抑制HBV复制的基础上，如果能够联合免疫调节药物如IL-2、IL-12、GM-CSF、Ⅲ型IFN (PEG-IFNλ)、重组乙型肝炎疫苗、合成肽疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫复合物等，不仅有助于恢复并提高机体的抗病毒免疫功能，亦有助于提高HBsAg阴转率。国内学者联合NAs、IFN、GM-CSF及乙型肝炎疫苗使HBeAg阳性CHB初治患者的HBsAg阴转率达到9.2%，NAs经治CHB患者HBsAg阴转率达到15.38%，同时对肝细胞内HBsAg和cccDNA的表达均有明显的抑制作用。此外，治疗性DNA疫苗、自体DC疫苗、抗PD-1抗体、TLR-7/8受体激动剂以及新型的生物免疫调节剂AIC649等多种免疫调节剂正在临床试验中[5-8]。

总之，基于免疫控制的治疗策略是通过活化和调节肝内天然免疫和获得性免疫、靶向精准清除HBV感染的肝细胞，并减少肝组织损伤。本期南方医科大学附属南方医院张小勇教授团队及南方医科大学附属深圳市第三人民医院张政教授团队分别围绕HBV感染相关天然免疫应答的研究进展、激活肝内天然免疫应答治愈CHB的新策略以及恢复或者增强HBV特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能进而实现CHB功能性治愈策略进行了详细介绍。

2.2.2 基础研究 针对TLR配体、RIG-I激动剂、STING激动剂、APOBEC3等天然免疫分子通路的基础研究提示，天然免疫的触发导致抗HBV应答和炎症介质的产生，并在不同程度上抑制病毒复制[18-25]。然而，仅激活天然免疫可能无法控制HBV感染，适应性免疫的诱导可能更为重要[26-29]。阻断免疫负调控信号进而增强特异性T淋巴细胞免疫的策略取得了一定进展，如联合应用PD-L1抗体、恩替卡韦和DNA免疫在土拨鼠肝炎病毒感染的土拨鼠中成功增强了病毒特异性T淋巴细胞功能，导致病毒复制持续受到了抑制，在部分动物体内清除了土拨鼠肝炎病毒表面抗原并产生了土拨鼠肝炎病毒表面抗体[30-32]。

此外，蛋白质/多肽疫苗、DNA疫苗、基于病毒的疫苗、DC疫苗也被用于探索恢复和重建慢性HBV感染者受损的适应性免疫。鉴于降低HBV抗原尤其是HBsAg水平将有助于适应性免疫的恢复，有学者对抗-HBs介导的免疫治疗策略进行了探索，虽然可以降低HBV DNA水平，但并未能实现持久的HBV抑制[33-35]。随着基因编辑和细胞工程技术进步，HBV特异性T淋巴细胞疗法成为可能。研究[36]表明，利用嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法和T淋巴细胞受体-T淋巴细胞技术产生的HBV特异性T淋巴细胞过继转移有利于HBV感染的免疫控制。但是其治疗CHB的有效性和安全性尚有待研究。

3 免疫控制治疗策略相关预测和评估指标

3.1 病毒学生物标志物 潜在的病毒学生物标志物包括如下几种。(1)血清HBsAg：由HBV cccDNA或整合的病毒DNA指导表达。HBsAg阴转是功能性治愈的主要标准之一。需要建立更敏感的以及能够区分来自整合HBV DNA和cccDNA的HBsAg的检测方法。(2)HBV cccDNA：迄今，尚缺乏标准化的肝内HBV cccDNA定量和转录活性分析，基于定量PCR的检测方法正在标准化。(3)循环HBV RNA：可以作为肝内cccDNA转录活性的直接指标。但是对于循环中HBV RNA的多样性、它们是如何被包装和释放的以及它们与cccDNA水平的相关性仍有待深入研究。定量分析方法也需要进一步优化。(4)血清乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)：HBcrAg水平与血清HBV DNA、肝内cccDNA和总HBV DNA水平密切相关，与血清HBsAg水平中度相关。HBcrAg的存在似乎预示着NAs治疗中止后病毒复发。由于许多HBeAg阴性患者无法检测到HBcrAg使得其临床价值受到限制，提高检测灵敏度有可能解决这一问题[37-38]。

3.2 免疫学生物标志物 由于CHB患者个体间遗传和免疫学背景差异较大，对外周血及肝内免疫细胞进行动态分析，将有助于基于感染免疫控制的功能性治愈策略的疗效预测及评估。流式细胞术、ELISOPT和ELISA等技术已经广泛用于分析HBV感染者体内细胞因子水平、免疫细胞表型和功能。但是，这些技术的标准化如HBV肽库的选择和四聚体质量的控制仍是巨大挑战。此外，虽然肝内免疫细胞及单细胞分析更能准确和全面反映患者免疫状态，但是肝活检的有创性极大地限制了其临床广泛应用。随着对B淋巴细胞在HBV感染免疫控制中重要性的认识，建立和完善B淋巴细胞表型及功能分析方法已成为乙型肝炎功能性治愈研究中亟待解决的重要问题之一[5-6]。

4 小结与展望

实现CHB功能性治愈有两种策略：(1)利用直接抗病毒药物在不杀死感染细胞的情况下抑制HBV复制，进而清除HBV；(2)利用免疫调节药物及分子恢复和重建CHB患者受损的免疫控制机制，安全清除HBV及其感染的肝细胞。现有资料提示，联合两种策略对患者进行个体化治疗与管理将是大多数CHB患者实现功能性治愈目标的重要途径。但是，如何实现两者的有效联合与精准调控，既能实现CHB的“治愈”，又不会造成严重的肝损伤和疾病进展仍是有待深入研究和解决的重大课题。

在HBV感染免疫控制机制中，HBV特异性T淋巴细胞应答扮演了极为重要的角色。但是，其他免疫细胞如B淋巴细胞、自然杀伤细胞、其他非实质性肝细胞、肝内微环境，以及非免疫性遗传等因素对控制HBV复制及清除HBV的重要作用亦越来越得到重视。这方面的研究值得进一步深入。此外，深入探索CHB免疫控制治疗策略相关的预测和评估指标，对CHB患者肝内受HBV感染肝细胞数量的精确量化研究不仅有利于更多患者实现功能性治愈，而且也有助于避免免疫调节治疗相关肝脏毒性，使得治疗过程更加安全。

总之，不论是在基础研究、新药研发、最优治疗目标人群确定、疗效预测和评估指标，还是抗病毒与免疫调节联合治疗方案及个体化治疗与管理策略等方面仍存在许多有待解决的问题和挑战，但CHB的功能性治愈仍是可实现的治疗目标。相信随着研究的深入，消除HBV对人类健康的威胁将不再遥远。