直接抗病毒药物在基因2、3型HCV中的耐药相关研究

陈宏宇， 徐小元

北京大学第一医院 感染疾病科， 北京 100034

慢性丙型肝炎患者的抗病毒治疗目前已经进入了使用直接抗病毒药物(direct-acting antivirals，DAA)的泛基因型时代。在已知的主要基因型和基因亚型的HCV感染者中，DAA都能达到90%以上的持续病毒学应答(SVR)[1]。但仍存在极小部分治疗失败的患者，表现为对DAA药物无应答，在治疗期间出现病毒学突破，或者是在完整疗程的DAA治疗后出现复发。与DAA治疗失败相关的原因有很多，如不同分期的肝病、遗传因素、免疫应答、性别、HCV的复制水平以及HCV基因型与基因亚型等等，而耐药相关置换(resistance-associated substitutions，RAS)在DAA耐药中起到很重要的作用[2-5]。本文将主要对与基因2、3型HCV相关的NS5B、NS5A两个基因片段中研究较多的RAS，在使用不同DAA方案的初治与治疗失败的患者中的分布差异进行阐述。

1 RAS相关概述

在定义RAS前，需先确定HCV基因型、基因亚型、HCV蛋白及氨基酸位点。以Y93H为例，第一个字母Y为所涉及到的氨基酸(即酪氨酸)，93为野生株中该氨基酸所在的位置，即肽链上第93个氨基酸，第二个字母H即为在病毒株中实际测得的氨基酸(即组氨酸)。也有部分患者会同时感染多种变异株，在同一位点存在多种氨基酸耐药突变(如：Y93Y/H/M)。这种耐药相关变异可在初次使用DAA治疗前就存在(称为预存耐药相关变异)，也可经抗病毒治疗后，在药物压力的选择下而出现[6]。由于DAA在治疗中的应用会使得HCV出现耐药突变的选择，在接受次优DAA方案的患者中，获得RAS的HCV是感染的主控因素，因此RAS对于重新接受丙型肝炎抗病毒治疗的患者是具有意义的。同时接受两类DAA治疗的患者出现失败的风险较低[7-8]。未发现干扰素联合利巴韦林的方案治疗对慢性丙型肝炎患者DAA天然耐药突变率存在影响[9]，但随着近年来对RAS研究的增加，RAS在HCV基因中的分布也发生着一定的变化。

2 RAS在NS5B中的分布

与NS5B基因片段相关的突变位点主要包括S282、L159、C316、M289、S556等。此外，在治疗失败的患者病毒株中测序还发现了V321、M414、A421等位点上的突变，但检测到出现这些突变的患者较少[10]。NS5B相关的RAS可存在于多种基因型的HCV中，且对DAA敏感性影响较小[11]。在以往的研究中，NS5B相关的RAS自然分布率较低。NS5B片段相关的RAS自然分布率大多<5%。基因2、3型HCV中自然分布率最高的RAS是S556G，它在2、3型HCV中分布率为100%[12]。NS5B片段中与基因2、3型HCV相关的RAS是L159F与S282T[13]。一项有关RAS的研究以患者初治时DAA方案为分组依据对治疗失败的患者进行分组，发现不同的组别间RAS分布率具有差异。其中初治时使用索磷布韦联合干扰素方案治疗的患者，NS5B相关RAS的分布率为66%，而初治时未联合干扰素治疗的患者中，NS5B相关RAS的分布率为20.4%；使用达塞布韦方案治疗失败的患者中，NS5B相关RAS的分布率为28.6%。在治疗失败的基因3型患者，NS5B相关的突变分布率约17%，NS5B突变的数量与类型均较少[14]。与其他基因片段上的RAS相比，在治疗失败的患者中NS5B相关的RAS分布率较低。与索磷布韦相关的耐药位点主要在L159、S282、V321，但这几个位点的RAS出现率都很低(低于10%)[15]。

2.1 S282位点相关的RAS S282T是唯一证实在体外具有耐药性的RAS，但S282T对药物敏感性的影响较小。当S282T在病毒中出现时，对索磷布韦半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)是野生型病毒株的2～16倍[15]。S282T的自然分布率在基因2型患者中为0.22%，在基因3型患者中为0.03%[16]。在一些研究中，S282T在DAA初治的患者中几乎未检测到。尽管在使用达卡他韦联合索磷布韦或莱迪派韦联合索磷布韦方案治疗失败的患者中可以监测到，但比率<1%，在使用索磷布韦联合维帕他韦组合治疗失败的患者中未发现S282T突变[17]。S282T在使用了包含索磷布韦且无干扰素方案的基因3型治疗失败患者中出现率为5%，而在其他DAA治疗方案失败的患者中，S282T的出现率极低，且分布率未发现明显统计学差异[18]。

2.2 L159与C316位点相关的RAS L159位点相关的RAS影响基因3型HCV对索磷布韦的敏感性，但影响较小，EC50较野生型病毒株倍数改变小于2倍[15]。C316位点相关的RAS可使病毒对达塞布韦耐药性增强，其对达塞布韦耐药的影响是NS5B位点相关的RAS中最强的。总体说来，L159F位点的RAS自然分布率为11.19%，而C316位点的RAS自然分布率为44.28%(其中包括43.09%C316N以及1.19%C316H)[16]。在基因3型HCV感染者中，约10%的患者出现L159F突变[14]。与野生型HCV病毒株相比，C316位点相关的RAS使病毒对达塞布韦药物EC50倍数的改变可超过1000倍[15]。有研究[19]发现在基因3型HCV感染者中，治疗失败组中L159F位点相关RAS的出现率约为15%，而在初治组中则<5%。

L159F与C316N也经常会在治疗失败的患者中同时出现。一项对治疗失败的患者进行深度测序分析的研究[10]发现，在使用莱迪派韦联合索磷布韦及达卡他韦联合索磷布韦治疗失败的患者中，L159F与C316N同时出现的概率分别为48.6%与50%。可见在使用索磷布韦治疗失败的患者中，近一半的患者体内感染的HCV基因中可检测到L159F与C316N同时出现的情况。

2.3 M289位点相关的RAS M289相关的RAS可在基因2型HCV感染者中出现，主要突变为M289L，其在基因2型中分布率约为1.8%[20]。但是它们对病毒耐药性的影响较小，与野生型病毒株相较，含有M289相关RAS的病毒株对索磷布韦的EC50倍数改变均小于2倍[17]。

2.4 NS5B片段其他位点相关的RAS 有研究[13]在基因3型HCV中观察到E237G与V321A等位点的突变，但并无详细的报道。过去在使用含索磷布韦的DAA治疗方案失败的患者中，可检测到A150V与K206E两个RAS，这两个RAS可能使病毒对索磷布韦敏感性产生影响。其中A150V使病毒对索磷布韦EC50改变为野生型病毒株的7.75倍，K206E造成的改变为8.34倍。在一项研究中报道，A150V的分布率约为50%，K206E的分布率接近20%，并且在有关SVR的分析中，有A150V的患者与无A150V的患者间SVR的差异具有统计学意义。此外，A150V与K206E两个RASs还可以同时出现于HCV基因中，当它们同时出现时，HCV对索磷布韦EC50倍数的改变比单个RAS存在时EC50倍数改变更高，EC50是野生型病毒株的35.77倍。研究[21]还发现，当病毒株中K100R与G188D同时出现时，对索磷布韦EC50的改变是野生型病毒株的31.8倍。

3 RAS在NS5A中的分布

与NS5A基因片段相关的RAS特点是其种类多，覆盖了广泛的基因型，并且具有较低的耐药屏障[11]。NS5A相关的RAS对病毒的耐药具有非常重要的影响。以往研究[22]显示，16%的基因3型HCV感染者在基线期时NS5A基因片段上可检测到RAS。在基因2、3型HCV感染者中，NS5A相关的RAS主要包括Y93、A30、L31等位点相关的RAS[13]。

3.1 Y93位点相关的RAS Y93位点相关的RAS可使病毒对多种药物产生耐药。Y93位点相关的RAS在基因2型HCV感染者中总体分布率约为1.49%，在基因3型HCV感染者中总体分布率约为3.5%[20]。在Y93位点上，与2、3型HCV有关的RAS为Y93H。在一项研究[18]中，使用莱迪派韦联合索磷布韦或达卡他韦联合索磷布韦方案的患者中，基因3型HCV初治患者Y93H总体出现率为2%，在莱迪派韦联合索磷布韦治疗失败的患者中出现率为0，但在达卡他韦联合索磷布韦治疗失败的患者中出现率高达66%。另一项研究[23]也对NS5A治疗失败的患者进行了耐药相关的研究，结果显示在使用莱迪派韦联合索磷布韦或达卡他韦联合索磷布韦治疗失败的基因3型HCV感染者中，Y93H在莱迪派韦联合索磷布韦经治患者中出现率为17.4%，而在达卡他韦联合索磷布韦经治患者中出现率高达70.6%，这一研究显示了在基因3型HCV感染者中，Y93H在使用不同DAA方案治疗的经治患者中出现率的差异，Y93H在接受达卡他韦联合索磷布韦方案治疗失败的患者中具有较高的分布率，这与前面的研究结果是一致的。

在与维帕他韦相关的研究中，与野生型病毒株相比，Y93H的出现对维帕他韦EC50倍数的改变在基因2a型HCV中为45.7倍，在基因3a型HCV中为723.5倍[24-25]。在基因3型HCV感染的肝硬化患者中，Y93H的出现会降低使用索磷布韦/维帕他韦治疗后的SVR率[26]。一项研究[27]对基因3型HCV感染者的治疗进行了分析，在使用索磷布韦联合维帕他韦的患者中，不伴有肝硬化的患者，基线时检测到Y93H突变且达到SVR的患者占90%，未检测到Y93H突变并达到SVR的患者占99%；伴有肝硬化的患者，基线时检测到Y93H突变且达到SVR的患者占50%，未检测到Y93H突变达到SVR的患者占93%。使用了维帕他韦方案治疗的基因3型HCV感染者中，既往治疗失败的患者里约80%出现Y93H突变，而初治的患者中仅约15%出现此突变。使用哌仑他韦的患者中，治疗失败患者中有约86%出现Y93H突变，而初治患者中仅14%出现此突变[19]。另外，有一项来自日本的研究[28]，对使用了格卡瑞韦联合哌仑他韦方案的患者进行了耐药相关研究，研究发现在基因1b型再治疗组中，患者基线时出现Y93位点上RAS的时候，SVR12会比不含这个RAS的患者更高(100% vs 80%，P=0.022)，但未对基因2、3型的患者进行类似的分析。

3.2 A30与L31相关的RAS A30与L31位点相关的RAS主要影响基因3型HCV对药物的敏感性。A30与L31相关的RAS在基因3型HCV中自然分布率分别为6.38%与5.79%[20]。这两个位点的RAS单独存在时，与野生型病毒株相较，A30K使病毒对达卡他韦EC50倍数改变为117倍，对维帕他韦为50倍；L31I使病毒对达卡他韦EC50倍数改变为240倍，L31M使病毒对达卡他韦EC50倍数改变为537倍，对维帕他韦EC50倍数改变为71倍。当病毒NS5A基因片段上A30与L31位点同时出现RAS时，病毒对药物的敏感性改变大大加强，当同时出现A30K与L31I时，病毒对哌仑他韦EC50倍数改变为3.6倍，对维帕他韦大于100倍[13]。一项研究[29]报道了在基因3型HCV感染、使用索磷布韦联合达卡他韦治疗失败，且基线期检测到A30K的患者中，67%在使用包含索磷布韦方案复治后达到了SVR12。A30K在治疗失败的患者中分布率约为55%，而在初治患者中，其RAS分布率约为21%[19]。L31位点相关的RAS在治疗失败的患者中出现率为71.4%[30]。在基因3型HCV感染者中，L31M在治疗失败患者中分布率约为8%，而在初治患者中仅约为2%[19]。

3.3 P32位点相关的RAS 在一项研究[30]中，P32del在治疗失败的患者中出现率为7.1%。P32del RAS对多种NS5A抑制剂具有较强的耐药作用[31]。此RAS主要影响哌仑他韦的治疗效果，使病毒对哌仑他韦EC50倍数改变为野生型病毒株的1032倍[32]。一项日本的研究[28]发现2例检测到P32del的患者，在格卡瑞韦联合哌仑他韦方案三期临床试验中均治疗失败，研究中认为P32del的出现会明显降低哌仑他韦的敏感性。目前关于P32del的研究相较其他RAS的研究较少，但随着格卡瑞韦联合哌仑他韦方案在国内上市，P32del RAS也应逐渐引起重视。

3.4 NS5A片段其他位点相关的RAS P58位点相关的RAS在基因2型HCV中分布率为2.74%，在基因3型HCV中分布率为14.45%，P58A使得基因2型HCV对维帕他韦的EC50倍数改变较野生型病毒株大于2.5倍，P58G使基因3型HCV对维帕他韦EC50倍数改变大于2.5倍[33]。S62位点相关的RAS在基因3型HCV中分布率为5.24%；V153位点相关的RAS在基因3型HCV中分布率为3.14%[20]。

4 总结

从2016年RAS相关的研究与2019年相关研究的对比中，有许多新的RAS被发现，有关RAS在药物压力选择方面的研究也增加。在DAA治疗失败的基因2、3型HCV感染者中，接受过不同DAA药物组合治疗后失败的患者，RAS的分布具有差异，反映出RAS对不同的DAA药物组合具有不同的影响。通过对RAS的检测可以优化DAA的治疗，但由于检测技术及成本等原因，RAS的检测难以在临床中广泛应用。DAA的出现使得丙型肝炎治愈成为了现实。无论是从临床试验的数据，还是真实世界的研究来看，DAA的治愈率都是可观的[34]。但由于HCV是RNA病毒，其具有易突变的特点，因此在DAA广泛使用的同时，继续对RAS进行相关研究仍是具有意义的[35]。

作者贡献声明：陈宏宇负责文献收集，撰写文章；徐小元负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。