基于心肌细胞能量代谢及钙稳态探讨附子作用机制

蒲科婷，王志琪，2*，李耀伟，邓凯文，张序晴，丛梦静，彭 兰，曾 嵘

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208；2.湖南省中药饮片标准化及功能工程中心，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙410208；4.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

附子是中医临床中常用的温阳药物，若辨证得法、使用得当则不论对慢性疾病或是危急重症均可取得显著疗效，然而在临床实践时因附子使用不当导致中毒甚至死亡的案例亦不在少数[1]。 汉代名医张仲景擅长使用附子类方剂，将其用于治疗各类虚寒疾病，究其本质在于附子可通过不同配伍、用法发挥程度不同的温阳作用，从而发挥不同的治疗作用[2]。但畏于附子之峻猛毒性，众多临床医家并不能放胆使用，从而导致其不能充分发挥疗效，故若能阐明附子温阳作用的毒效关系与机制，不仅可指导其临床安全用药，还可为研究此类毒效并存的药物提供思路方法[3]。

中医阴阳学说认为人与自然界的生命都是由阴阳二气演化而来[4]。 中医脏腑理论认为心属火，为阳中之阳，其主一身之血脉的功能有赖于心阳的温煦推动作用；现代医学认为心脏维持正常的搏血功能需要保证其有充足的能量供应及有力量有节律的收缩舒张，这与心阳之温煦推动作用相吻合。基于此，课题组通过文献学习和网络药理学筛选发现：附子类方剂治疗心衰的作用机制与调节磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated proteinkinase, AMPK）通路改善能量代谢及调节钙调蛋白（calmodulin, CaM）改善钙稳态有关，且AMPK 能量代谢通路及CaM 两者之间存在关联，故以此对附子温心阳的相关机制加以论述。

1 附子温心阳作用与调节AMPK 通路的关系

1.1 心衰心脏的能量代谢

现代研究认为阳气的温煦功能与能量代谢有关，如阳虚体质的大学生能量代谢数据，脾阳虚大鼠、肾阳虚大鼠线粒体功能研究均表明在阳虚状态下机体能量代谢水平明显降低[5-8]。 健康成年人的器官中能量需求最大的是心脏[9]，正常情况下，心肌细胞所需的约95%的三磷酸腺苷主要由脂肪酸和碳水化合物经线粒体分解代谢产生，另有不到5%的三磷酸腺苷来自糖酵解[10]。在心力衰竭状态下，心肌细胞产生三磷酸腺苷的能力、对脂肪酸的摄取能力和利用率均明显下降[11-12]；与此同时，未被利用的脂肪酸促使线粒体内膜上的解偶联蛋白合成增多，过量的解偶联蛋白降低了线粒体膜两侧的质子电化学梯度，阻碍了三磷酸腺苷的生成；此外，解偶联蛋白还促进了活性氧的产生，而活性氧可进一步的引起线粒体受损；如此的恶性循环致使心肌处于能量严重缺乏状态[13]。在代偿机制下，心肌细胞的糖酵解和磷酸戊糖代谢有所增强，导致代谢产物乳酸的水平升高[14]，然而乳酸会损伤心肌细胞，故心肌细胞的此种代偿不仅未能改善衰竭心脏的能量代谢，反而加重了心肌细胞损伤。

1.2 AMPK 通路与能量代谢的调节

AMPK 是一种丝氨酸苏氨酸激酶，由于AMPK对细胞内能量代谢情况非常敏感，常将其视为反映机体能量代谢功能的指标[15]，AMPK 通路的激活则是体内对抗并改善能量代谢不足的机制之一。细胞内三磷酸腺苷的浓度、磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）与三磷酸腺苷比值的变化均可影响AMPK 的激活[16]，进而使其调节细胞能量代谢。

心衰时，心肌细胞所产生的三磷酸腺苷不足，AMPK 通路被激活并通过多种途径提高了细胞对能量代谢底物脂肪酸与葡萄糖的摄取和利用，促进细胞内糖原的分解等，从而增加了心肌细胞内的三磷酸腺苷。活化的AMPK 调节细胞能量代谢的具体作用环节有增加脂肪酸转运体FAT/CD36 和膜相关脂肪酸结合蛋白FABPpm 的蛋白表达和质膜含量[17]，升高细胞内葡萄糖转运体GLUT4 的水平并促进其向心肌细胞膜移位[18]；抑制糖原合成酶活性并增强糖原磷酸化酶活性，以此调节细胞内的糖原合成改善糖代谢[19]；增加磷酸果糖激酶的表达[20]。

除了对细胞能量代谢底物进行调节，AMPK 还可减少活性氧的产生从而缓解其对线粒体的损伤[21]，提高细胞内线粒体的数量、促进线粒体DNA 的复制和转录等以改善心肌细胞内能量代谢。其中后者的机制比较复杂，主要涉及过氧化物酶体增殖物受体共激活因子1α（peroxisome proliferators-ctivatedrecep tors co-activator, PGC-1α） 和线粒体转录因子A（mito chondrial transcription factor A, mtTFA）。 其 中，PGC-1α 既可调节线粒体的氧化代谢，亦可调控线粒体的基因表达，而mtTFA 的主要功能为调控线粒体的合成。心肌细胞内活化的AMPK，以磷酸化的方式激活PGC-1α，激活的PGC-1α 与细胞核呼吸因子1（nucleus respiratory factor 1, NRF1）、细胞核呼吸因子2（NRF2）及ERRA 转录因子发生相互作用，从而激活mtTFA，最终增加线粒体的转录与合成[22]；心肌细胞内磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增大也可激活AMPK，被活化的AMPK 促进了细胞内尼克酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase, Nampt）的表达，进而提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平，使得沉默信息调节因子1（silent information regulator 1, SIRT1）被激活，活化的SIRT1 以脱乙酰化反应激活PGC-1α，AMPK 通过此途径也可促进线粒体的转录合成[23]。

1.3 附子作用于AMPK 通路以改善心肌能量代谢

近期，有学者从AMPK 通路研究了附子对能量代谢影响。其中，LU 等[24]研究表明干姜附子水煎液既可明显促进心衰大鼠心肌细胞中SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2 4 种蛋白mRNA 的表达，还可明显提高大鼠心肌细胞内SIRT1、PGC-1α、NRF1、NRF2蛋白的含量，因此，干姜附子配伍改善心功能可能是通过调节AMPK 通路改善心肌细胞中线粒体的功能实现的。DENG 等[25]的研究认为附子中的苯甲酰乌头碱可能是其调节AMPK 通路的主要活性物质，实验发现BAC 可增强小鼠耗氧量，促进小鼠肝细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞中线粒体mtDNA 的复制，增加三磷酸腺苷的生成；苯甲酰乌头碱还能提高线粒体中AMPKα、PGC-1α、NRF1 等与AMPK 通路相关蛋白的表达。 上述研究成果提示，附子温心阳作用与调节AMPK 通路改善能量代谢的作用直接相关，可以此为基础开展更深入的探究。

2 附子温心阳作用与改善钙稳态的关系

2.1 心肌的舒缩与钙稳态

中医学认为心主一身之血脉，而心脏推动全身血液运行，有赖于其有力量有节律的搏动；生理学认为心脏能够正常的舒张收缩的基础是心肌细胞正常的兴奋性。 中医学心阳虚证一般被认为与现代医学中的急慢性心力衰竭的主要症状比较相似，心衰时心脏搏血力量不足且往往伴随心律失常[26]。 而钙离子对心肌细胞兴奋性具有重要作用，故心肌细胞内钙稳态及其变化与心脏之推动功能可能密切相关，如若心肌细胞内钙稳态被破坏，心脏功能也将受到影响。

在多种门控蛋白的配合下，心肌细胞中的钙离子浓度能够维持正常的动态变化，以完成心肌正常的收缩-舒张。肌浆网是存储Ca2+的主要细胞器，心脏收缩初期所需92%的钙离子由其提供[27]。其调节钙离子浓度的具体途径为：当心肌细胞兴奋时，心肌细胞膜上的L 型Ca2+通道（LTCC）开放，细胞外少量Ca2+经LTCC 进入细胞，进而激活肌浆网的兰尼碱受体钙释放通道（ryandine receptor calcium release channel, RyRs），引起其发生“钙致钙”释放；释放进入胞质的Ca2+与肌钙蛋白结合，伴随消耗一定量的三磷酸腺苷，引起心肌收缩[28]；在心肌兴奋-收缩完成后，心肌细胞内的Ca2+主要由肌浆网钙泵及Ca2+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶将其从胞浆内转入至肌浆网再次储存；细胞内的Ca2+还可在钠钙交换体（sodium-calcium exchanger, NCX）和Na+-K+-ATP 酶的配合下以“一钙出，三钠进”的方式转出[29]，当心肌细胞内的钙离子浓度降至7～10 mol/L 时，心肌细胞舒张，但是无论心肌收缩或舒张均需消耗三磷酸腺苷。

2.2 钙调磷酸酶与钙稳态

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/camodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ）是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是CaM家族中重要的一员。在正常的心肌细胞中，70%的钙离子由肌浆网重新摄取，剩余的30%由NCX 转出细胞外[30]。活化的CaMKⅡ可直接磷酸化肌浆网钙泵导致肌浆网回摄钙离子的能力下降低，还可磷酸化NCX1使其不能将钙离子转出细胞，以致心肌细胞内钙超载，钙稳态被破坏，导致心肌收缩舒张的时间延长，心肌收缩力不足，最终引发或加重心衰。

CaMKⅡ的结构中的结构域部分共有4 个Ca2+结合位点，其中2 个位点被占据，只有当心肌细胞内游离的钙离子浓度增高时，升高的钙离子方能与其余2个Ca2+结合位点结合[31]，继而激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ可通过磷酸化多种CaM，包括LTCC、RyRs、NCX 等，影响钙稳态的调节。如激活的CaMKⅡ可再次开放LTCC 引发钙超载[30]，还可减少RyR2 的关闭量，使原本储存于肌浆网的钙离子大量外流[32]。

2.3 附子对CaM 的作用

近年来，关于附子调节CaM 的研究逐渐增加，研究表明附子苷促进大鼠心脏中CaM 的作用与药量呈正相关[33]；附子可纠正阳虚大鼠钙调蛋白的表达，提示附子温阳作用与调节钙调蛋白有关[34]；而高剂量的附子则可增强其心脏中CaMKⅡ的表达并加重大鼠心衰[35]。对附子主要活性成分乌头碱的深入研究则显示，乌头碱可促进大鼠心室肌细胞膜上LTCC开放，引起钙超载，最终导致心律失常[36]；乌头碱所引发的钙瞬变幅度降低而频率增加效应与其剂量呈正相关，且可通过下调肌浆网钙泵、上调RyR2 的表达引起钙超载[37]；附子中的另一成分次乌头碱可促进心肌细胞LTCC 和RyR2 mRNA 的表达，导致钙超载，继而诱发心律失常[38]。

3 附子对心脏及AMPK、CaM 的作用

以上论述表明，心阳之温煦推动作用与心肌细胞线粒体的能量代谢及钙稳态密切相关，而线粒体的功能与钙稳态调节之间存在着密切联系：一方面，维持钙稳态需要充足的三磷酸腺苷；另一方面，心肌细胞内的钙稳态是心肌细胞线粒体生成三磷酸腺苷的前提，同时线粒体可吸收胞浆内游离的Ca2+以缓冲心肌细胞内过高的Ca2+[39]。

胞浆中的Ca2+要进入线粒体，必须经线粒体上的钙单向转运复合体（mitochondrial calciumuniporter，MCU）转运，而只有高浓度的Ca2+才能激活该通道。MCU 由必要的线粒体Ca2+单向转运复合体调节器、线粒体Ca2+摄取器1（mitochondrial calciumuptake one,MICU1）和线粒体Ca2+摄取器2（MICU2）组成[40]。 因此，当胞质内Ca2+浓度增加时，MCU 开放增加，促使线粒体吸收游离的Ca2+以调节钙稳态；但当Ca2+浓度过高时，则会破坏线粒体内部的钙稳态，继而损伤线粒体的结构及功能[41]。而当能量代谢不足时，线粒体内产生的活性氧又会直接或间接地促进Ca2+内流；可见心肌细胞的钙稳态及线粒体内的钙稳态和线粒体的功能之间存在密切联系。

实验研究发现，乌头碱配伍甘草次酸可显著降低心肌细胞乌头碱中毒所致的RyR2 过表达， 同时增加NCX1 的表达，缓解细胞内钙超载，并通过调控心肌细胞膜L 型电压门控钙通道蛋白的表达，增强心肌细胞的收缩功能[42]；附子煎液可降低线粒体膜电位，增加细胞内活性氧含量，破坏线粒体功能，并可抑制PGC1-α 的表达，从而降低线粒体缓冲细胞内Ca2+浓度的作用[43]；而干姜附子汤在改善心衰的同时可上调MCU、MICU1、MICU2 蛋白的表达，提示其治疗心衰的作用可能与调控MCU 改善线粒体功能有关[44]；参附注射液可改善心衰大鼠心肌细胞内线粒体结构及功能，增加三磷酸腺苷产量，还可增加衰竭心肌细胞的肌浆网钙储量、降低胞质内钙离子浓度，间接增强心肌细胞收缩力，促进心衰大鼠心功能的恢复[45]。上述实验及结果提示，附子温心阳作用机制可能与改善线粒体功能及调节钙稳态相关，且两者之间存在联系。

综上所述，心阳之盛衰与心肌细胞能量代谢及钙稳态相关，而线粒体功能是联系细胞能量代谢和钙稳态的一个枢纽，因此，可以调控线粒体与胞质内钙离子浓度变化的关键通路MCU 为切入点，将AMPK-CaM 通路相结合探究附子的温阳作用及其毒效关系，通过检测MCU、MICU1、MICU2 的表达并与线粒体及胞质内钙离子浓度变化相联系，有望表征附子温心阳的毒与效。

4 小结

由于中医学阳气概念是对人体多种功能宏观整体的概括，而附子的温阳功效亦是对多途径多靶点整体调节作用的概括，且中药的药效是以辨证论治为基础，故在研究时应以附子及其配伍组合的整体药效为研究对象，以多通路多靶点结合的方式对其进行研究，如此可更加贴合中医药之整体观念，再以中医辨证论治思想为指导，通过对比其对不同证型下心脏或心肌细胞的作用，可更加全面的说明其毒与效，故以AMPK-CaM 通路结合研究附子温心阳作用机制并探索其毒效关系，或可更加接近其作用本质。