HDAC抑制剂在吉非替尼治疗EGFR突变型非小细胞肺癌中的疗效增强作用实验研究

李 巍，冯卫能，叶国麟

(佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000)

肺癌在癌症相关死亡中排第一位，非小细胞肺癌约在所有肺癌中占85%[1]。近来，根据驱动基因进行靶向治疗的理念已经形成，其中EGFR基因突变是靶向治疗的一个最重要的驱动基因[2]。EGFR-TKI已成为一线治疗EGFR突变型晚期非小细胞肺癌患者的首选方法。但另一方面，虽然同为EGFR突变型晚期非小细胞肺癌患者，EGFR-TKI的疗效仍然存在较大差异，有20%～30%患者无效，有的患者PFS超过1年，而有的患者初始治疗有效但很快出现疾病进展。近年来，越来越多的临床前研究结果显示乳腺癌易感基因1(BRCA1)表达与突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI疗效相关。最近公布的高质量的临床研究结果进一步证实了BRCA1表达与EGFR-TKI治疗突变型非小细胞肺癌的疗效相关。在予EGFR-TKI一线治疗的突变型晚期非小细胞肺癌患者中，BRCA1高表达者的中位PFS为10个月，而BRCA1低表达者的中位PFS长达27个月，两者具有非常大的差异。而且，两者疗效的差异与是否存在T790M突变及c-MET基因扩增无关，BRCA1是影响疗效的独立因素[3]。这些研究结果提示抑制BRCA1的表达可望进一步提高晚期非小细胞肺癌对EGFR-TKI的疗效。最近研究发现，HDAC抑制剂(伏立诺他)可减少转录因子E2F1与BRCA1启动子结合而下调BRCA1转录，从而间接抑制BRCA1表达[4]。因此，本文的研究目的是探讨HDAC抑制剂是否可以通过降低乳腺癌易感基因BRCA1表达增强EGFR-TKI对突变型非小细胞肺癌的作用。

1 研究方法

1.1实验细胞：培养人肺癌细胞株H460(K-RAS突变)和非小细胞肺癌细胞株H1975(EGFR合并T790M突变)，K-RAS突变可导致原发耐药，对吉非替尼不敏感，而H1975虽然是EGFR突变型，但它同时含L858R(增加敏感性)和T790M(增加抗性)突变，T790M是吉非替尼获得性耐药的主要原因(占50%～60%)，所以对吉非替尼也不敏感。

1.2构建高表达BRCA1基因的肺癌细胞株：胎盘中提取总RNA，设计引物，RT-PCR方法克隆BRCA1基因，以羧基端插入pcDNA3.1 ( + )真核表达载体中。通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性。提取质粒pcDNA3.1-BRCA1，用lipofectamine 2000转染肺癌细胞，获得稳定高表达BRCA1细胞株(H461和H1976)。提取细胞总蛋白，Western blot方法鉴定转染细胞BRCA1表达情况。

1.3检测伏立诺他增强突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI敏感性的作用：①实验细胞株及细胞培养： 取处于对数生长期的H461和H1976细胞接种培养板，按以下实验分组予不同处理。②实验分组：分为以下两组：EGFR-TKI组：以吉非替尼10 μmol/L处理；伏立诺他联合吉非替尼组：以吉非替尼10 μmol/L+伏立诺1.0 μM处理；③培养24～48 h后收集细胞，应用MTT法检测药物对H461和H1976细胞增殖的抑制，应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4检测伏立诺他对EGFR突变型非小细胞肺癌BRCA1表达的影响：取处于对数生长期的H461和H1976细胞，予伏立诺1.0 μM处理，培养24～48 h后收集细胞，应用Western blot检测各组细胞BRCA1蛋白表达水平，应用RT-PCR检测各组细胞BRCA1基因的mRNA水平。空白对照组：加入相应体积1640培养基。

2 结果

2.1伏立诺他增强突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI敏感性：实验分为两组后，EGFR-TKI组(对照组)以吉非替尼10 μmol/L处理；伏立诺他联合吉非替尼组(实验组)以吉非替尼10 μmol/L+伏立诺他1.0 μM处理。应用MTT法检测药物对H461和H1976细胞增殖的抑制，应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。对于细胞株H460，ED50 (半数有效剂量)在实验组和对照组分别是21.4 μM和33.0 μM；对于细胞株H1975，ED50在实验组和对照组分别是27.8和31.7 μM。见表1。

表1 伏立诺他增强突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI敏感性

2.2伏立诺他对BRCA1表达的影响：取处于对数生长期的H461和H1976细胞，予伏立诺他1.0 μM处理(实验组)，培养24～48 h后收集细胞，应用Western blot检测各组细胞BRCA1蛋白表达水平，应用RT-PCR检测各组细胞BRCA1基因的mRNA水平。空白对照组：加入相应体积1640培养基。通过RT-PCR法发现，对于H1976细胞，实验组BRCA1基因的mRNA水平减少>85%；对于H461细胞，实验组BRCA1基因的mRNA水平减少>75% (见表2、图1)。通过Western blot方法，可以清晰地发现实验组BRCA1基因表达显著降低。

表2 伏立诺他对H461和H1976细胞BRCA1表达的影响

图1 伏立诺他使H461和H1976细胞的BRCA1表达降低

3 讨论

EGFR酪氨酸激酶域的突变已被证实与非小细胞肺癌对TKI治疗的敏感性密切相关。Paez等研究表明，在对吉非替尼治疗敏感的、具有EGFR突变的美国患者中，吉非替尼治疗只对敏感的肺腺癌细胞株有生长抑制作用，但不包括不敏感的肿瘤或细胞系[5-6]。对接受EGFR-TKI治疗的非小细胞肺癌患者进行EGFR基因突变的检测是预测治疗反应的最重要的因素。根据基因状况而形成的靶向治疗已经拉开帷幕并渐渐对传统治疗显露优势[2]。对于存在EGFR19、21外显子突变的晚期非小细胞肺癌患者，一线应用EGFR-TKI治疗的有效率高达70%～80%，中位PFS显著提高到9～14个月，而中位生存期也大幅度延长至30个月左右[7-8]。因此，EGFR-TKI已成为一线治疗EGFR突变型晚期非小细胞肺癌患者的首选方法。但另一方面，虽然同为EGFR突变型晚期非小细胞肺癌患者，EGFR-TKI的疗效仍然存在较大差异，有20%～30%患者无效，有的患者PFS超过1年，而有的患者初始治疗有效但很快出现疾病进展。此种情况是在EGFR-TKI治疗EGFR突变型晚期非小细胞肺癌取得巨大进步的同时呈现的另一重要新问题。

既往有相关研究认为，EGFR活化突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI疗效的差异是因为存在EGFR-TKI原发性耐药及获得性耐药。原发性耐药可能与c-MET基因扩增、PTEN表达缺失、肝细胞生长因子(HGF)高表达等有关。而50%的获得性耐药及20%的获得性耐药分别与出现T790M突变、c-MET基因扩增有关[9]。

目前认为肿瘤的发生与机体内组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶的失衡密切相关，肿瘤细胞中发生组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)异常表达，组蛋白大部分呈低乙酰化状态。HDAC抑制剂(histone deacetylaseinhibitor，HDACi)能使肿瘤细胞中组蛋白乙酰化水平提高，纠正肿瘤细胞中组蛋白异常的乙酰化状态，诱导肿瘤细胞凋亡[10]。最近研究发现，HDAC抑制剂可减少转录因子E2F1与BRCA1启动子结合而下调BRCA1转录，从而间接抑制BRCA1表达[4]。本研究中通过HDAC抑制剂伏立诺他，对于H1976细胞，加入伏立诺的实验组的BRCA1基因的mRNA水平减少大于85%；同样，对于H461细胞，实验组的BRCA1基因的mRNA水平减少 >75%。通过Western blot方法，我们可以清晰地发现实验组的BRCA1基因表达显著降低。从而使伏立诺他联合吉非替尼的实验组的ED50低于只加入吉非替尼的对照组。其中，对于细胞株H460，ED50 (半数有效剂量)在实验组和对照组分别是21.4 μM和33.0μM；对于细胞株H1975，ED50在实验组和对照组分别是27.8 μM和31.7μM。因此，增强了突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI敏感性。

近年来，越来越多的临床前研究结果显示乳腺癌易感基因1(BRCA1)表达与突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI疗效相关。BRCA1定位于人染色体17q12—21，编码蛋白含有1 863个氨基酸残基。BRCA1通过蛋白之间的相互作用来发挥其重要的生物学功能，包括细胞周期调控，DNA损伤修复，基因的转录调节，细胞凋亡和泛素化等[11]。BRCA1作为DNA损伤修复过程的核心分子，在DNA损伤修复中发挥至关重要的作用。在理化因素导致DNA损伤后，激活γ组蛋白2A变异体(γ histone family 2A variant，γH2AX)自磷酸化，磷酸化γH2AX促进BRCA1招募各种修复蛋白形成多种BRCA1复合体聚集在DNA损伤位点进行损伤修复[12]。而另一方面，目前许多研究证明EGFR除了通过RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK、PI3K/AKT和Src/STAT三条主要信号通路调控细胞的分化、凋亡外，还具有促进DNA损伤修复的功能[13，14]。同样，EGFR-TKI除了可以抑制上述通路的信号传导，还可以通过抑制DNA损伤修复发挥作用[15]。因此，BRCA1高表达可能可以通过增强DNA修复功能降低突变型非小细胞肺癌对EGFR-TKI的疗效。最近公布的高质量的临床研究结果进一步证实了BRCA1表达与EGFR-TKI治疗突变型非小细胞肺癌的疗效相关。在予EGFR-TKI一线治疗的突变型晚期非小细胞肺癌患者中，BRCA1高表达者的中位PFS为10个月，而BRCA1低表达者的中位PFS长达27个月，两者具有非常大的差异。而且，两者疗效的差异与是否存在T790M突变及c-MET基因扩增无关，BRCA1是影响疗效的独立因素[3]。这些研究结果提示抑制BRCA1的表达可望进一步提高晚期非小细胞肺癌对EGFR-TKI的疗效。但目前尚未有直接抑制BRCA1表达的抑制剂。

总之，HDAC抑制剂伏立诺他能使H460和H1975细胞对吉非替尼更敏感。其机制可能与降低H460和H1975细胞的BRCA1基因表达有关，而伏立诺作为EGFR-TKI联合用药的实际价值和性价比仍需要更大样本的前瞻性的设计研究。