通过宏基因组学研究肠道微生物对结直肠癌患者影响的最新进展

李智杰 赵 琦 吴华星

最新全球癌症统计报告显示，在全球癌症发病率中，结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的发病率在人群中排名第三，死亡率排名第二[1]。全球癌症负担正在迅速增加，中国情况也不容乐观。Arnold等[2]发现近十年中国结直肠癌发病率和死亡率都迅速上升。随着中国工业化和城市化的快速发展，人们的生活方式和环境发生巨大变化，不健康的生活方式、不良饮食以及污染导致结直肠癌引起的死亡率持续增加。几十年来，研究人员一直在癌症的形成过程、促进癌症进展的原因和对治疗反应的机制等方面努力探索，在这样的情况下，人类微生物群和微生物组对人体各系统的作用引起了研究人员的关注，越来越多的证据表明人体中微生物不仅与维持人体健康有关，而且与多种疾病的发展有关，甚至包括癌症[3]。宏基因组学作为微生物研究的一种重要研究方法，在微生物与结直肠癌研究中发挥越来越重要的作用。近年来，通过宏基因组学研究肠道微生物菌群的变化为结直肠癌的发生发展提供了新的见解，并且强调了癌症微生物群中宿主-微生物和微生物间相互作用的重要性。

1 宏基因组学

宏基因组学概念最早是在1998年由Handelsman等[4]提出，宏基因组指环境中所有微生物的基因总和。广义宏基因组指特定生态环境下所有生物遗传物质的总和，以生态环境中全部生物DNA作为研究对象，应用宏基因组学方法研究其彼此之间的相互关系。狭义宏基因组学指特定生态环境下全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，应用宏基因组学方法研究其彼此之间的相互关系[5]。与传统方法相比，宏基因组方法是从生物样本中取得全部微生物的基因组，不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括大量的传统方法无法研究的不可培养的微生物。传统方法中大多数分子检测仅可以使用特异性引物或探针靶向有限数量的病原体，但宏基因组方法可以表征样品中存在的所有DNA或RNA，从而能够分析患者样品中的整个微生物组以及人宿主基因组或转录组[6]。

2 微生物与结直肠癌

微生物对于人体并不陌生，因为人体在出生时就与母亲的阴道和皮肤的微生物群相接触[7]。人体中有数以万计的微生物以与人体细胞共生的方式存在于人体中，而与身体其他部位相比，最大的人类相关微生物群落存在于胃肠道中。它们以非常微妙的关系平衡共存，通过调节宿主的代谢功能和肠上皮结构，来影响免疫系统和防止病原体的定植进而帮助维持肠道稳态。大量研究表明，肠道微生物组紊乱与许多疾病的发生密切相关，如消化系统疾病、心血管系统疾病、呼吸系统疾病、内分泌疾病、精神疾病、自身免疫性疾病以及癌症等。已有研究表明幽门螺杆菌与胃癌及其癌前病变有密切关系，幽门螺杆菌产生损伤因素减弱胃粘膜的保护因素，使胃粘膜上皮细胞发生恶性转化[8]。但肠道微生物与结直肠癌的关系尚未明确，有研究表明肠道微生物可通过多种途径引发结直肠癌的发生。肠道微生物可通过引起慢性炎症引发组织损伤和再生的重复循环，并产生氧化应激，导致上皮细胞中DNA损伤的累积，最终导致肠道肿瘤的发生发展[9-10]。肠道微生物群的生态失调也可以引发许多与肿瘤形成过程有关的免疫应答进而导致结直肠癌的发展。如肿瘤内的炎症环境通过激活NF-κB和STAT3信号传导并上调促增殖和细胞周期驱动基因来促进癌症发展[10-11]。越来越多的证据表明，结直肠癌的发生不仅通过人类肠道微生物群的诱导，而且还受更广泛的微生物群落，特别是其代谢物的影响。有数据表明[12]，短链脂肪酸乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯在抑制炎症和癌症中起作用，而其他微生物代谢物如继发性胆汁酸则可促进癌症发生方面起作用，说明肠道微生物代谢产物具有抗炎和抗癌的双重作用。

3 通过宏基因组学研究肠道微生物与结直肠癌的关系

3.1 宏基因组学：肠道细菌菌群与结直肠癌

人体肠道微生物以细菌群落占多数，最新研究报道中，Almeida等[13]通过宏基因组学在11 850个人类肠道微生物组中重建了92 143个宏基因组装配的基因组，并鉴定出了肠道中存在的1 952个未培养的候选细菌物种。使用宏基因组测序可以将细菌种群鉴定到物种水平，并且可用于分析肠道微生物群功能。在正常人体肠道中细菌主要由厚壁菌、拟杆菌、放线菌和变形杆菌组成[14]。应用宏基因组学对结直肠癌人群中肠道细菌进行分析，发现与健康人群肠道细菌菌群相比，结直肠癌样本中物种的丰富度较高[15]。研究人员通过对来自中国、奥地利、美国、德国和法国队列的526个宏基因组样本进行分析，发现在结直肠癌人群中有7种细菌含量丰富，其中有6种已被报道过与某些但不是所有人群的结直肠癌相关[16]。这6种细菌分别是：Bacteroides fragilis、Fusobacterium nucleatum、Porphyromonas asaccharolytica、Parvimonas micra、Prevotella intermedia和Alistipes finegoldii。其中Bacteroides fragilis可以在宿主细胞中产生破坏DNA的基因毒素[17]，Fusobacterium nucleatum通过在结直肠癌微环境中诱导炎症和宿主免疫应答来促进肿瘤发展[18]，卟啉单胞菌也被鉴定为与不同人群的结直肠癌相关[19]，Parvimonas micra在结直肠癌中显著富集，并且在中国队列中发现Parvimonas micra与Fusobacterium nucleatum强烈相关[20]。在先前的研究中已经发现Alistipes属与结直肠癌相关，并从结直肠癌患者的血培养中分离出了Alistipes finegoldii[21]。在结直肠癌丰富度高的菌种中，有四种细菌(Porphyromonas asaccharolytica、Fusobacterium nucleatum、Prevotella intermedia、Parvimonas micra)在人类口腔中也存在，已有报道发现口腔细菌和结直肠癌之间存在相关性[22]。在结直肠癌人群中，除细菌丰富度改变外，细菌之间的相互作用也可以维护肠道微生物群的稳定，其破坏可有助于结直肠癌的发生，一些共生细菌的减少可以对结直肠癌中显著富集的细菌抑制作用降低，使其丰度增高。在结直肠癌中Parvimonas micra与Fusobacterium nucleatum强烈相关，但这两种细菌在正常健康对照组中丰度并不显著，表明结直肠癌环境可能是形成这种相关性的重要因素，这两种菌群在结直肠癌中可能存在协同作用。

3.2 宏基因组学：肠道真菌菌群与结直肠癌

目前大多数肠道微生物研究都集中在细菌微生物群上，但越来越多的证据表明，与细菌微生物群一样，真菌微生物群经常在疾病状态中发生变化，真菌生态失调对结直肠癌的发生也有影响。粪便中的真菌数量远远低于细菌数量，每克粪便中含有105～106个真菌细胞，而细菌细胞为1011个[23]。但真菌细胞的长度是细菌细胞的10倍，体积是细菌细胞的100倍，这表明真菌生物量和真菌衍生的代谢物不能仅从细胞数量上与细菌进行比较[24]。

环境中大约存在10万种真菌，但其中只有300种已知可引起动物或人类感染[25]。在健康的人体肠道中，整体真菌多样性低于细菌[26]，一般<20种[27]，并且个体间变异性高[26]。在大多数人胃肠道中发现有10个属含量丰富，被认为可能是核心肠道真菌菌群：假丝酵母属(特别是白假丝酵母)、酿酒酵母属(特别是酿酒酵母)、青霉属、曲霉属、隐球酵母属、马拉色属(特别是马拉色菌)、枝孢属、半乳糖酵母、德巴利酵母和丝孢酵母[28-29]。有研究表明，肠道真菌组成的变化与结肠直肠癌发生有关。Coker等[30]通过宏基因组学方法首次证明粪便真菌谱可以预测结直肠癌，与细菌和其他临床参数无关。研究中发现，反映真菌失调的担子菌与子囊菌的比率在结直肠癌中的值高于对照组。与对照组相比，在结直肠癌中马拉色菌增加，而酵母菌和肺气球菌减少。在科的层面上，结直肠癌中Lipomycetaceae显著减少，而Pisolithaceae、Marasmiaceae、Malasseziaceae、Erysiphaceae、Pseudorotiaceae和Chaetomicaeae增加，在属的水平上，结直肠癌有六种真菌含量丰富，包括Malassezia、Moniliophthtora、Rhodotorula、Acremonium、Thielaviopsis和Pisolithus。这些结果表明肠道真菌菌群生态失调可能在结直肠癌中发挥作用。粪便真菌失调可能为使用真菌物种作为结直肠癌的非侵入性诊断生物标志物开辟新的机会。

3.3 宏基因组学：肠道细菌-真菌相互作用与结直肠癌

许多研究结果表明细菌和真菌在肠道内相互作用，通过不同程度的共生作用相互影响。这些相互作用可分为三大类：互惠、共栖和竞争[24]。由于结直肠癌的复杂性和多因素性，这种共生作用被破坏，可能在结直肠癌的发生中发挥作用。研究发现[30]，健康人对照组比结直肠癌组中真菌与细菌之间的相关性少，在结直肠癌组中可观察到强烈的共排他性关系。在对照组中，发现子囊菌门(Leotiomycetes、Sordariomycetes、Eurotiomycetes和一类未分类的毛霉菌)与细菌变形杆菌门(Proteobateria)的α-变形菌(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和β-变形菌纲(Betaproteobacteria)具有协同关联性。相反，在结直肠癌组中，Pucciniomycetes、Exobasidiomycetes和Malasseziomycetes，其与主要细菌类别(包括α-变形菌、γ-变形菌、δ-变形菌纲和纤维粘网菌)形成显著的共排他性。此外，在对照组中真菌类锤舌菌纲、粪壳菌纲和散囊菌纲的共生相互作用，在结直肠癌组中被转变成共同排斥作用，这揭示了在健康人体内肠道微生物通过共生协同的关系维持动态平衡，但在结直肠癌中这种动态平衡却被破坏。这些研究结果表明肠道中的真菌和细菌之间存在复杂的关系，它们之间的拮抗作用可能导致结直肠肿瘤的发生。

4 小结与展望

越来越多的证据表明，肠道微生物群的改变可能是结直肠癌发生或进展的促进因素。通过宏基因组学的研究，已发现肠道细菌、真菌以及细菌-真菌相互作用可能有助于结直肠癌的发生。但目前宏基因组学在肠道微生物群研究方面仍存在一些不足。随着技术的不断进步，未来我们可以将宏基因组学与宏蛋白组学、宏转录组学、宏代谢组学等多组学研究方法相结合，从而进一步了解肠道微生物对结直肠癌患者的影响，确定针对结直肠癌诊断具有特异性的微生物标志物和有益微生物，以期望获得更好的结直肠癌诊断工具和治疗方法。