EphB6受体在恶性肿瘤中的研究进展

包 乐 唐丽萍

癌症侵袭性在实体肿瘤患者的死亡中起着重要作用，细胞黏附和迁移的解除原因是怀疑驱动侵袭行为。促红细胞生成素肝细胞受体(Erythropoietin-producing hepatocellular，Eph)家族是酪氨酸激酶受体家族中最大的一个亚族，至少包括14个受体和8个配体，Eph受体分为A型(1-10)和B型(1-6)，其相应的Ephrin配体也分为EphrinA(1-5)和EphrinB(1-3)[1]，其与配体Ephrin的相互作用控制着细胞的黏附、迁移和增殖，可能决定癌症侵袭性的程度。与这些作用一致的是，部分Eph成员已证实参与了肿瘤的发生发展，其中EphB6因其激酶结构域的改变而缺乏催化能力使其具有特殊性，其广泛表达于人体的很多正常组织。检测多种恶性肿瘤组织发现EphB6表达下调，并且其低表达水平与肿瘤的发生发展相关，而在各种肿瘤细胞系中EphB6具有抑制肿瘤细胞异常增殖、迁移、侵袭的作用。因此，EphB6被认为是一种潜在的肿瘤抑制因子。随着对EphB6的进一步研究发现，EphB6的表达缺失与其启动子的高甲基化状态有关，降低EphB6启动子甲基化水平可恢复EphB6的表达，从而参与肿瘤抑制作用。然而EphB6在肿瘤中的具体作用的研究尚未完善，现就EphB6在部分肿瘤中的作用及其部分机制予以阐述。

1 Eph/Ephrin的结构特点及功能

Eph受体为跨膜I型糖蛋白，包括三个结构域：糖基化的胞外区、胞内区(具有酪氨酸激酶活性的功能区)和连接二者的跨膜区(由疏水氨基酸组成)[2]，胞外区中N端球状结构域决定了受体与配体结合的特异性；胞内区中的突出后密度蛋白——大盘-密闭小带(Post-synaptic density protein，Discs large，Zonula occludens，PDZ)结构域能够识别Ephrin并结合，Eph受体和Ephrin配体通过纳摩尔亲和力结合形成活性四聚体复合物[3]，进而导致受体的激活，致其自身磷酸化，磷酸化的Eph-Ephrin通路进一步激活其下游因子。异于其他信号传导的方向，Eph受体同Ephrin配体相结合后为双向信号传导，其特殊性导致后续的信号处理复杂化[4]，也有助于在不同生理和病理状态下Eph-Ephrin信号的精细调控，从而参与内皮细胞的增殖、迁移、重塑等过程[5-6]。

自1980年代发现Eph以来，Eph受体和Ephrin配体被发现参与了人体中越来越多的生理和病理过程，不仅参与神经和血管系统的发育，还参与肿瘤的发生发展。研究表明，Eph受体和Ephrin配体结合诱导相反的反应，如细胞黏附或排斥，促进或抑制细胞增殖和细胞迁移，以及进展或抑制多种恶性肿瘤。在Eph家族中，EphB6是一种激酶非活性的Eph受体，其激酶结构域包含多种保守氨基酸的改变。EphB6表现出很多抑癌基因的特性。与正常组织相比，EphB6在乳腺癌[7]、结直肠癌[13-17]、黑色素瘤[11]、胃癌[23-24]等肿瘤组织中表达下调，并且往往导致肿瘤发生发展及侵袭性增强。随着对EphB6的更深入研究，其有望成为肿瘤诊断、治疗和判断预后的新靶点。

2 EphB6与恶性肿瘤

2.1 EphB6与乳腺癌

女性乳腺癌死亡率很大程度上归因于原发乳腺癌的转移，Fox等[7]为了更好的探究EphB6在乳腺癌发展中的潜在作用，检测了不同乳腺癌细胞系中EphB6的表达情况。研究发现，在四种侵袭性乳腺癌细胞系中，有三种侵袭性乳腺癌细胞系中均发现了EphB6的缺失，在非侵袭性乳腺癌细胞系中却含有大量的EphB6蛋白，而以EphB6蛋白过表达载体转染了侵袭性乳腺癌细胞系后，发现侵袭性乳腺癌细胞系的体外侵袭性显著下降，可以证明EphB6能够降低乳腺癌侵袭能力。

在其发生机制方面，他们的另一项研究利用甲基化特异性PCR实验证实EphB6启动子在侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发生高甲基化，使EphB6在侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达沉默，符合之前的实验结果，EphB6的低表达可导致肿瘤的侵袭性增强，而用去甲基化5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理侵袭性乳腺癌细胞系后可促使EphB6受体重新表达，降低肿瘤的侵袭能力，而这正证实了EphB6甲基化后可失去其表达功能，进而增强了肿瘤细胞侵袭性的可能[8]。

为了进一步证实在侵袭性乳腺癌细胞系中EphB6启动子甲基化使其表达沉默的可能性，Kandpal等[9]做了进一步实验。他们利用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)区分甲基化和非甲基化的EphB6启动子，来预测EphB6的转录本及蛋白的表达。发现MSP是一种检测EphB6的表达敏感性极高的实验方法，且既往实验显示，EphB6的表达是乳腺癌肿瘤表型的一个指标，进而推测，EphB6的MSP可作为乳腺癌的潜在诊断和预后检测方法。

作为乳腺癌最致命的类型，三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)具有较高的耐药性及转移性，并且缺乏靶向治疗。Toosi等[10]发现，在TNBC中，EphB6受体可部分逆转TNBC细胞的上皮-间质转化(EMT)，通过RAS-ERK的信号通路增加了干细胞多能性调节基因(OCT4)的表达，从而增加了肿瘤起始因子(TICs)种群的扩张，而表达EphB6受体的TICs种群被证明对阿霉素治疗更敏感，可能意味着EphB6能够将其转化为增殖更快、抵抗力更弱的细胞，说明表达EphB6受体的TNBC可具有更高的药物敏感性，未来对TNBC的治疗将更有效。

2.2 EphB6与黑色素瘤

Hafner等[11]实验结果显示，在mRNA水平上，与良性痣相比较，黑色素瘤及转移瘤上EphB6的表达呈进行性显著下降。免疫组化结果显示，普通痣染色EphB6染色均匀，黑色素瘤细胞及转移瘤染色从异质性阳性转完全阴性。证明黑色素瘤疾病进展到转移性疾病与EphB6基因表达显著降低有关，这将对恶性黑色素瘤患者的预后及今后的基因靶向治疗产生较重要的影响。

为了填补细胞-微环境在调节迁移行为中的作用研究方向的空白，Bailey等[12]利用胚胎神经嵴高度的侵袭性，以它作为模型来探究转移性黑色素瘤细胞-微环境相互作用，发现肿瘤细胞-微环境相互作用在促进、抑制和指导肿瘤细胞运动方面均起到了重要作用，同时观察到EphB6受体的重新表达迫使转移性黑色素瘤细胞偏离鸡胚胎移植模型典型迁移模式，显著降低了转移潜能，而且在绒毛膜尿囊膜(CAM)转移试验中，表达EphB6的黑色素瘤细胞显示转移潜能显著降低。上述实验结果阐明了EphB6的抗转移特性，恢复EphB6蛋白表达可能是转移性恶性黑色素瘤的基因治疗方法。

2.3 EphB6与结直肠癌

潘笑露、陈昌浩等[13-14]的研究结果显示，与癌旁组织相比，结直肠癌组织EphB6蛋白表达下调，结合临床病理资料结果，EphB6基因和蛋白在肿瘤组织中表达下调与转移有关，例如EphB6表达下调与临床分期、病理分期及淋巴转移相关，但尚未发现其表达下调与浸润深度和分化程度具有相关性。说明EphB6表达丢失可能参与肿瘤的早期发生及肿瘤进展过程，并且导致预后较差。

Peng等[15]进一步证实上述观点，他们采用免疫染色法及PCR法分别检测结直肠癌及邻近正常组织的蛋白和mRNA水平。结果提示，与腺瘤和正常组织相比，结直肠癌中的EphB6的蛋白表达降低，并且83.8%的癌组织中检测到低水平的EphB6 mRNA表达，结直肠癌中EphB6蛋白的丢失与分化不良、淋巴结转移、Dukes分期及浸润深度呈正相关，并且淋巴结转移患者预后较差，一并揭示EphB6低表达与患者整体生存期差有关。

Mateo-Lozano等[16]使用EphB6小鼠敲除模型，发现EphB6的丢失不会有效的引起肠道肿瘤发生，同时与其他EphB受体不同，EphB6不参与腺瘤向癌转变的早期进展，然而，研究人员重新在含有结肠癌细胞的免疫缺陷小鼠尾静脉注射EphB6后却显著降低了免疫缺陷小鼠中肺内结肠癌细胞的转移生长。相反，在对照组的实验模型中，EphB6的下调导致转移病灶数量的增加。一致的，与180例原发肿瘤患者相比，在存在淋巴结转移的患者中，EphB6表达明显降低。总之，此实验首次证明了EphB6在结直肠肿瘤转移扩散中的作用。

在另一组研究中，彭李博等[17]在结直肠癌和正常肠上皮细胞细胞系中应用实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR两种方法分别检测EphB6 mRNA的表达情况和DNA甲基化状态，实验结果提示启动子甲基化可能是EphB6受体在结直肠癌中低表达或缺失的机制之一。综上所述，EphB6可能是结直肠癌的保护性基因，可抑制结直肠癌的转移及抑制肿瘤进展。

2.4 EphB6与非小细胞肺癌(NSCLC)

Bulk等[18]应用体内实验表明，突变的EphB6表达增强了NSCLC的体内转移，其低表达与早期NSCLC不良预后密切相关。EphB6表达减少与突变失活导致的EphB6功能缺失可能是肺癌转移的原因之一。铁茹等[19]在体内体外实验中均证实稳定表达EphB6的A549肺癌细胞系可增加细胞的黏附能力，降低肿瘤细胞的迁徙能力，铁茹、Yu等[20-21]采用过表达和RNA干扰方法也分析了EphB6在NSCLC中的生物学功能。研究显示，在mRNA水平和蛋白质水平上，与正常组织相比，NSCLC肿瘤组织中的EphB6 mRNA和EphB6蛋白水平明显降低，并同时证明EphB6基因启动子区的高甲基化是导致NSCLC中的EphB6 mRNA表达下降和蛋白质表达水平降低的重要原因，而在用5-aza-2′-脱氧胞苷处理NSCLC细胞株后，可使EphB6的表达恢复，增加了细胞黏附，充分表明EphB6的表达可降低肿瘤细胞的迁移，而高甲基化则是其中一重要机制。尽管关于EphB6对NSCLC发生发展的相关机制研究还不是特别明确，但以上实验均提示EphB6是一种肿瘤转移抑制因子，其启动子在NSCLC中经常被高甲基化而沉默，恢复其表达有可能为预防NSCLC发生转移提供新的方法。

2.5 EphB6与卵巢浆液性癌

丁洁等[22]采用免疫组化方法观察EphB6在卵巢癌的蛋白表达情况。此实验结果同乳腺癌、NSCLC研究结果类似，从正常输卵管、卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤到卵巢浆液性癌，EphB6表达呈进行性显著降低，EphB6在卵巢浆液性癌中也表现出抑癌基因的功能，同时实验表明EphB6缺失表达或低表达主要见于高级别浆液性卵巢癌及晚期患者，EphB6蛋白表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期及Ki-67表达均有关(P<0.05)，随访结果显示，EphB6高表达患者预后明显优于低表达患者。Gu等[23]也证实了EphB6在卵巢浆液性癌中的这种低表达特性。在卵巢肿瘤中EphB6的研究较少，其作用机制尚不清楚，通过其既往在其他恶性肿瘤中的研究，我们推断其机制可能与EphB6启动子区甲基化或免疫系统调控相关，也为后续探究卵巢癌诊治提供新思路。

2.6 EphB6与胃癌

Liu等[24]首次探讨了EphB6在胃癌中的临床意义，他们发现，EphB6在胃癌中有差异表达，在52.6%的胃癌标本中低表达，在32.9%的标本中中度表达，在14.5%的标本中高表达。与正常粘膜表达相比，胃癌组织中EphB6表达显著降低。EphB6蛋白表达与肿瘤分化呈正相关，与淋巴结转移、肿瘤分期呈负相关。EphB6启动子区CpG岛的高甲基化、突变和microRNA调控可能导致胃癌组织中EphB6的表达降低。陈昌浩等[25]也对EphB6在胃癌中的表达进行了相关实验，结果与Liu等的结论类似，都表明EphB6作为一种转移抑制因子参与胃癌的发生，将可能会是胃癌治疗的潜在分子靶点，而具体机制仍有待进一步研究。

2.7 EphB6与前列腺癌

越来越清楚的是，EphB6在多种恶性肿瘤中有着重要的临床意义，为了证实EphB6在前列腺癌中是否起到相同的抑癌作用，Mohamed等[26]采用免疫组化的方法探究在正常前列腺组织中和前列腺癌组织中EphB6受体的表达情况，并结合相应的临床病理特征验证与癌症进展的关系。实验结果显示，与正常前列腺组织比，EphB6在前列腺癌中的表达明显降低，并且研究发现，在体积>4 cm3的癌组织中EphB6受体表达明显低于体积<4 cm3的前列腺癌组织，说明至少在癌症的早期阶段，EphB6对前列腺癌起到抑制作用。并且在其机制方面，Fox等[27]用5-aza-2′-脱氧胞苷处理前列腺癌细胞系，同样发现EphB6启动子甲基化是其失活原因。总之，现有研究表明EphB6在各种恶性肿瘤中表达下调，甲基化可参与调控EphB6表达沉默。

3 小结及展望

EphB6受体在肿瘤发生发展过程中起到抑制肿瘤进展，控制肿瘤转移的作用，尽管在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中分子作用机制得到部分研究，但其参与肿瘤的发生发展的复杂调控机制仍未明确，并且EphB6在宫颈癌发生发展中所起到的作用还存在空白。未来我们可以进行大量的临床试验，探究EphB6与宫颈癌的关系，找寻宫颈癌治疗的新方向。总之，EphB6与恶性肿瘤发生发展息息相关，其表达水平有助于判断患者预后情况，并有望成为独立预后因子，并为靶向药物研究和临床治疗提供新的方向。