Wnt信号介导的肝巨噬细胞与肝祖细胞相互作用在肝纤维化发生与修复中的意义

简 迅， 徐 莹， 刘 平， 慕永平

上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学肝病研究所， 上海 201203

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经之路，其病理特征为肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节的形成。无论任何病因，慢性肝病进展到肝纤维化，均涉及肝实质的慢性损伤、持续的炎症反应、纤维化的持续进展和创伤愈合反应[1]。因此，如何改善肝脏病理微环境，即抑制肝脏炎症反应，促进肝祖细胞向有利于肝功能修复的肝实质细胞分化，成为肝纤维化治疗研究的热点。本文重点就巨噬细胞和内源性肝祖细胞在肝纤维化发生和修复过程中的作用，以及两者之间的“对话”机制进行概述。

1 肝脏巨噬细胞的起源及其在肝纤维化发生与修复中的作用

巨噬细胞起源于单核细胞前体，是广泛分布的吞噬性天然免疫细胞，具有吞噬、抗原提呈和活性分泌等多种功能，在组织内稳态和宿主防御中发挥重要作用[2]。巨噬细胞一旦定位于肝脏，即表现出较高的吞噬活性，以清除门静脉来源的内毒素和有害物质[3]。肝脏巨噬细胞根据其来源可分为肝脏固有的巨噬细胞(Kupffer cell，KC)和循环中的单核巨噬细胞[4-5]。KC来源于卵黄囊和胎肝单核细胞，其表型特征为：F4/80hi、CD11blo、CD169+、CD68+、Mac-2+和CD80lo/-[6-8]。 其主要功能是清除血液中的微生物和细胞碎片，清除老化的红细胞，确保肝脏内环境稳定[9-10]。 循环中单核细胞的表型特征为：F4/80int、CD11bhi和CD80hi，其主要功能是免疫监测[8]。当肝损伤时，KC可最早发现损伤并启动炎症级联反应，通过分泌趋化因子CC基序配体(CC-motif ligand 2, CCL2)，募集外周淋巴细胞抗原6复合物，位点C(lymphocyte antigen 6 complex, locus C, Ly6C)+单核细胞大量浸润[11]，Ly6C+单核细胞可分泌多种炎性细胞因子如TNF α、IL-1β、IL- 6、IL-12/23(P40)等，促进炎症反应[12]。此外，Ly6Chi单核巨噬细胞还可分泌TGFβ1和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)-BB，介导肝星状细胞(HSC)转化为肌成纤维细胞[13]，分泌大量细胞外基质(ECM)，促进肝纤维化的进展[14]。同时，脾脏内的Ly6Clow单核细胞被募集进入肝脏后，可促进肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)和基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)-2/-9/-12/-13等的表达，进而促进损伤肝组织的修复[15]。因此，肝脏巨噬细胞在肝损伤的不同阶段或修复反应中被激活，发挥促炎、促纤维化或促进创伤愈合/修复等作用[16]，提示调节巨噬细胞的活化状态对肝纤维化的修复具有重要的临床意义。

2 巨噬细胞极化状态决定肝纤维化进展或修复

巨噬细胞是组织内稳态的精密传感器，具有高度的可塑性，可根据环境信号快速地在促炎(M1巨噬细胞)和抗炎(M2巨噬细胞)之间进行表型转换，称之为巨噬细胞极化，M1和M2巨噬细胞在转录表达谱、细胞表面标志、细胞因子等方面均具有高度异质性，对纤维化肝脏中的ECM的沉积和组织重建发挥着双重调节作用[17-18]。

巨噬细胞极化过程由复杂的分子机制调控，目前认为干扰素调节因子/信号转导和转录激活因子/细胞因子信号抑制剂家族(interferon regulatory factor/signal transducer and activator of transcription/suppressor of cytokine signaling, IRF-STAT-SOCS)是其关键调节者。简而言之，INFγ和Toll样受体(toll-like receptor,TLR)激活STAT1，促进M1极化，同时上调SOCS3，抑制M2极化；IRF5和IRF8通过Notch信号通路促进M1极化。IL-4和IL-13激活STAT6，促进M2极化，同时上调SOCS1，抑制M1极化；IL-10和IL-3分别激活STAT3和STAT5，促进M2极化[19]。在来自细菌的脂多糖(LPS)或损伤、炎症产生的细胞因子等信号的影响下，巨噬细胞经历经典活化并分化为M1巨噬细胞，其特征是产生炎性细胞因子，如TNFα、IL-6以及活性氧等，它们的细胞毒性使得M1巨噬细胞在清除病原体的同时引发炎症反应，尽管这种反应对宿主具有保护作用，但持续的炎症反应对宿主极为不利。为了保护宿主免受这种炎症损害，巨噬细胞可被IL-4和IL-13替代激活并分化为M2巨噬细胞，产生IL-10等抗炎细胞因子，参与凋亡细胞的吞噬、炎症消退、血管生成、组织修复与重塑等[20-21]。提示巨噬细胞极化在组织稳态、疾病发生、炎症及其消退中发挥至关重要的作用[22]。研究[23]表明部分肝切除后，采用脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(Cl2MDP)选择性耗竭KC，既可阻断肝脏IL-6、IL-10和TNFα mRNA的合成，也可降低HGF和TGF β1 mRNA表达，延缓肝再生。最新研究表明KC内质网的Nogo-B蛋白可促进M1极化，促进酒精性肝病进展；Nogo-B缺失则可促进M2极化，促进酒精性肝病的恢复。提示KC与肝再生和损伤修复的关系极为密切[24]。

此外，目前认为M2型巨噬细胞可分为3个亚群：M2a、M2b和M2c[25]。M2a由IL-4或IL-13激活，在肝纤维化的逆转过程发挥关键作用，如通过高表达的IL-10和低表达TNFα、IL-12引起免疫抑制；通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体促进HSC凋亡；通过MMP-2促进胶原降解等途径促进ECM的降解和组织重塑[25-26]。M2b由Fcg受体、TLR或IL-1R诱导分化，是肝脏常驻的巨噬细胞类型，在正常肝脏中表达IL-1β，通过免疫复合物提高IL-1、IL-10和TNFα表达，发挥免疫调节作用，并驱动Th2细胞免疫反应[27]。M2c由IL-10诱导分化，在纤维化形成过程中，通过高表达TGFβ1和PDGF促进HSC活化增殖与胶原合成，进而促进肝纤维化的进展，并通过高表达MMP-2/-9/-12/-13降解正常ECM[26-27]。也有研究[28]认为肿瘤相关巨噬细胞可以称作M2d巨噬细胞，主要通过促进血管生成，促进肿瘤的发展。以上研究提示，调控巨噬细胞的极化状态对于肝损伤的修复具有重要的临床意义。

3 Wnt信号介导纤维化肝脏巨噬细胞与肝祖细胞相互作用

近年来，再生医学在难治性疾病领域彰显出明显优势，理论上，基于干细胞移植的再生医学拥有光明前景，但由于其安全性、成本、副作用以及体内生存能力等问题而受限。因此，近年来，干细胞移植的替代治疗策略受到广泛关注，该策略主张充分发挥内源性干细胞的功能，即通过调整干细胞的微环境，使内源性干细胞增殖并分化为组织修复所需的细胞类型，从而避免活检、体外细胞扩增和移植等复杂过程[29]。在肝脏中，未分化但具有干细胞功能的细胞群体被称为内源性肝祖细胞(以下简称为肝祖细胞)，具有分化为肝细胞或胆管上皮细胞的潜能，其分化方向取决于所处的微环境，与巨噬细胞极化状态和Wnt信号通路活化尤为密切。

Wnt信号通路在组织再生与修复过程中发挥重要作用，其配体Wnts蛋白(Wnt1～11等)主要来源于巨噬细胞[30]。Saha等[31]研究表明，来源于巨噬细胞胞外囊泡包裹的Wnts可保护肠道干细胞，提高放射损伤后肠道干细胞的生存率，而Porcupine(PORCN)在Wnt核心配体分泌机制中不可或缺，采用PORCN抑制剂Wnt-C59消除巨噬细胞的Wnts分泌功能后，其对肠道干细胞的保护作用减弱，为Wnts来源于巨噬细胞提供了直接证据。近年来，作为干细胞微环境的重要组成部分，巨噬细胞在肝再生领域受到普遍关注[32]。

在肝纤维化进展期，肝祖细胞可向肌成纤维细胞和胆管上皮细胞分化，发挥促纤维化作用。一方面，在肝纤维化进展期，由M1巨噬细胞释放TNFα等激活肝祖细胞的非经典Wnt信号通路(如Wnt5/frizzled2)，促进肝祖细胞向肌成纤维细胞分化[33]。在此过程中，巨噬细胞通过吞噬坏死的肝细胞或分泌CCL2/3募集CCR2+Ly6Chigh的炎性单核细胞浸润，分泌肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducible factor of apoptosis, Tweak)，Tweak与其受体Fn14相互作用，促进肝祖细胞进一步增殖[34]。Liu等[35]研究表明，对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝细胞癌模型注射外源性肝祖细胞后，可促进肝纤维化的进展，可能与LPS/TLR4信号通路介导肝祖细胞向肌成纤维细胞转化有关。笔者前期研究结果表明，在2-乙酰氨基芴(2-AAF)/CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，肝祖细胞可向肌成纤维细胞分化，发挥促纤维化作用；体外研究表明阻断Wnt信号通路可阻断肝祖细胞向肌成纤维细胞分化[33]。另一方面，在肝纤维化进展期，伴随肝实质细胞数量和功能的衰减，出现以门静脉周围肝祖细胞活化为特征的“胆管反应”，目前已证实新生的胆管上皮细胞可分泌TNFα、TGFβ、PDGF、IL-1、IL-6、IL-8、单核细胞趋化因子-1等多种促纤维化细胞因子，促进门静脉周围的成纤维细胞和HSC活化为肌成纤维细胞，合成大量的ECM，促进肝纤维化的发生与发展[36]。此外，损伤的肝细胞还可通过分泌危险相关分子模式激活祖细胞壁龛内的HSC[37]。活化的肝祖细胞还可反过来通过CCL2和CX(3)CL1等趋化因子，激活巨噬细胞分泌Tweak、调节激活正常T淋巴细胞表达和分泌细胞因子和细胞间黏附分子等途径诱导炎症细胞浸润，促进肝纤维化的进展[38]。

在肝纤维化恢复期，肝祖细胞主要向肝实质细胞分化。目前已证实肝祖细胞向肝实质细胞分化过程主要由经典的Wnt/β-Catenin信号通路调控，其机制可能与M2巨噬细胞吞噬凋亡的肝细胞碎片后释放Wnt3A，激活肝祖细胞经典Wnt/β-Catenin信号通路，促进其向肝实质细胞分化有关[39]，且Wnt3A还可促进IL-4或TGFβ1诱导的巨噬细胞M2极化[40]。临床研究[41]表明，在儿童非酒精性脂肪性肝病，促炎巨噬细胞占主导地位，二十二碳六烯酸治疗可使巨噬细胞极化为抗炎表型并上调Wnt3A表达，促进肝祖细胞β-Catenin磷酸化并使其向肝细胞分化。以上研究提示Wnt信号介导了肝脏巨噬细胞与肝祖细胞间的“对话”，基于巨噬细胞极化或Wnt信号通路的调控研究有可能成为抗肝纤维化治疗的新途径。

4 小结

综上所述，巨噬细胞和肝祖细胞在肝纤维化发生与修复过程中发挥重要作用，巨噬细胞M1极化可分泌IL-6、IL-1、TGFβ、PDGF等，促进肝脏炎症反应和HSC活化；并可通过释放TNFα等激活肝祖细胞非经典Wnt信号通路，促进其向肌成纤维细胞分化。而在肝纤维化恢复期，巨噬细胞M2极化可激活肝祖细胞经典Wnt信号通路，诱导向肝实质细胞分化，促进肝纤维化修复。因此，近年来，改善肝损伤或纤维化的治疗研究主要集中在肝巨噬细胞，这些干预措施主要通过调节KC的活化、炎性单核细胞迁移、巨噬细胞极化和分化等发挥作用[15]。但许多研究只是在器官层面进行免疫功能分析，并没有明确肝脏巨噬细胞的表型。也有学者[42]认为肝纤维化恢复期的Ly6C+单核细胞具有与M1/M2不同的表型，甚至认为M1/M2定义在很大程度上不适用于肝病。因此，目前对于肝脏巨噬细胞表型转换的潜在机制还缺乏充分的认识，未来需要对肝巨噬细胞的基因组和表型进行深入的研究，并进一步明确其调控肝祖细胞分化的机制，为肝纤维化的临床治疗提供科学依据。