非常规样本在免疫抑制剂治疗药物监测中的应用进展

张瑞霞，张弋（天津市第一中心医院药学部，天津 300192）

人体实体器官移植经过60 多年的发展，在全世界挽救了许多的生命。维持移植后器官的功能是至关重要也是最为艰难的一步，免疫抑制剂通过对免疫系统的抑制作用可以避免移植物的不适当自我排斥反应，极大地提高了患者移植物的存活率。临床常用的免疫抑制剂如他克莫司、环孢素、霉酚酸等由于其具有个体间及个体内差异大、治疗窗窄等特点，标准剂量的治疗并不适用，对其进行治疗药物监测 （therapeutic drug monitoring，TDM）尤为重要。

目前在临床，免疫抑制剂TDM 通常是根据移植物的类型和使用的免疫抑制剂进行血药谷浓度分析。其治疗范围是根据疗效和毒性确定的，既确保有效预防排斥反应同时避免药物毒性。也有研究建议监测药时曲线下面积［1-3］，通过这种强化的TDM可以减少急性移植物排斥反应。但是尽管如此， 在移植后的前两年，急性排斥率仍然很高 （约8% ～ 15%，最高可达30%）［4-5］。而且器官移植患者进行免疫抑制治疗是一个长期的过程，研究其他与疗效与毒性相关性更好的、更方便的监测方法可以减少患者的疼痛，增加患者依从性。本文对非常规样本在免疫抑制剂治疗药物监测中的应用进展做一综述，以期为寻找更适用于临床的免疫抑制剂TDM 方案提供思路与帮助。

1 细胞内免疫抑制剂浓度测定

1.1 外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）血药浓度：淋巴细胞是免疫抑制药物的作用靶细胞。钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）通过与细胞内特异的结合蛋白形成复合物竞争性与钙调磷酸酶结合抑制其作用。依维莫司和西罗莫司抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。霉酚酸抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径，从而干扰DNA 的合成。所有这些抑制机制都发生在淋巴细胞中。因此，研究PBMC 中药物浓度理论上可以更好地预测药物的疗效和毒性。

目前已有多篇研究测定了他克莫司在PBMC中的浓度，但是大部分仅限于方法学的建立，仅有少数阐述了其浓度与排斥反应之间的关系。 Capron 等［6］最早在2009 年建立了LC-MS/MS 测定他克莫司PBMC 浓度的方法，他克莫司在肾移植患者（n ＝65）中PBMC 谷浓度范围为6 ～ 179 pg/106cell，同时研究还证实他克莫司全血浓度与PBMC 浓度之间的相关性较差。相似的结论在在肝移植患者［7］和心脏移植患者［8］中也得到了证实。但是也有研究［9］认为在移植功能处于稳定状态的患者，全血浓度与PBMC 浓度具有显著的相关性 （r ＝0.67，P ＜0.001）。对于影响PBMC 中他克莫司浓度的因素，Capron 等［10］证实存在于淋巴细胞中的ABCB1 以及CYP3A5 多态性会影响他克莫司在PBMC 中的药代动力学，这也可能是导致全血中药物浓度与PBMC 浓度相关性较差的原因。该团队还通过对比在肝移植人群中发生排斥与非排斥组中他克莫司PBMC 中的浓度差异证实了测定PBMC浓度的潜在临床意义。在这项研究中，作者共纳入90 例只接受他克莫司治疗的成人肝移植受者，在第1、3、5 和7 天监测全血和PBMC 中他克莫司浓度，并在第7 天进行肝组织活检以评估是否发生排斥反应并计算BANFF 评分［7］。研究中分别有 37 例（41.1%）出现组织学排斥反应，12 例（10.8%）患者出现临床排斥反应（需要治疗的患者）。组织学排斥患者组的PBMC 他克莫司浓度显著低于未发生排斥组患者，但两者全血浓度没有差异。两组PBMC中他克莫司浓度在第3天分别为（21.6±16.3） 和（78.6±36.5） pg/106cell，第5 天为（27.6±12.2）和（83.8±32.6） pg/106cell，第7 天为（33.8±16.7）和（90.9±41.2） pg/106cell。而临床排斥患者中的他克莫司浓度也显著低于第7 天没有临床排斥的患 者， 分 别 为（22.2±6.1）pg/106cell 和（48.7± 11.9） pg/106cell。此外，研究还证实PBMC 中的他克莫司浓度越低，第7 天的BANFF 评分越高（r ＝0.90，P ＝0.0013）。相反，在第7 天他克莫司全血浓度与BANFF 评分之间没有相关性。

对环孢素在PBMC 中的浓度研究也较多， 最早在2007 年已有液质联用测定PBMC 中环孢素浓度的报道［11］。对于环孢素血药浓度与PBMC浓度之间相关性以及ABCB1 基因多态性对其浓度的影响在各个研究结果中有所差异。Ansermot 等［12］测定了19 例健康志愿者PBMC 中环孢素的药代动力学曲线，研究结果显示环孢素血药浓度与PBMC 浓度无相关性（P ＝0.71），且ABCB1 基因多态性对环孢素在PBMC 中的浓度的影响也较小。Crettol 等［13］测定了64 例肾、肝或肺移植受者ABCB1 基因型、环孢素PBMC 和血药浓度。研究结果显示环孢素PBMC 浓度与血药浓度呈中度相关 （r ＝0.30，P ＜0.00005）。ABCB1 1199A 携带者的环孢素PBMC 内浓度与非携带者相比降低了1.8 倍 （P ＝0.04），而3435T 携带者的血药浓度增加了 1.7 倍（P ＝0.02）。对于评估测定环孢素PBMC 浓度的临床价值，Falck 等［14］评估了20 例肾移植患者T 淋巴细胞中环孢素浓度和全血浓度，其中有7 例患者出现急性排斥反应，在发生排斥反应前3 d 检测到患者中细胞内环孢素浓度显著下降，而全血浓度无明显变化。由此可证明测定PBMC 中环孢素浓度具有潜在的临床价值。

对于西罗莫司和依维莫司在PBMC中浓度的研究相对较少，目前仅有少量方法学报道。Masri 等［15］研究了42 例成人肾病患者给药前、给药后1 h 和2 h 的3 个不同时间全血和淋巴细胞西罗莫司浓度。结果描述了T0、T1和T2的细胞内浓度与淋巴细胞计数之间呈负相关，未描述血液和细胞内西罗莫司水平之间的相关性。Rheil 等［16］建立了LC-MS/MS 方测定PBMC 依维莫司浓度的方法。该测定法被应用于36 例成人心脏移植患者。依维莫司在PBMC 浓度约40 ～ 470 pg / 106cell，与血液浓度具有显著相关性（r ＝ 0.558，P ＝0.0002）。除此之外Robertsen 团队［17］在11 例肾移植受者的研究也发现依维莫司全血和PBMC 中的AUC0-12h表现出强烈的相关性（r ＝0.90，P ＜0.01）。ABCB1 基因多态性对全血和PBMC 中依维莫司浓度无影响。

霉酚酸是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶（inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）的选择性可逆抑制剂，对其PBMC 中浓度的研究［18］发现，血浆和PBMC 霉酚酸浓度之间存在显著相关性（P ＜0.05），IMPDH 活性与霉酚酸血浆浓度之间的相关性比PBMC浓度更好（P＜0.01比P＞0.05）。 该结果不支持霉酚酸PBMC 浓度比血浆浓度具有更好预测疗效的价值。

从上述的数据可看出对于钙调磷酸酶抑制剂PBMC 浓度比全血浓度预测排斥反应更有潜力， 而mTOR 抑制剂（西罗莫司、依维莫司）和抗代谢物（霉酚酸）则未找到相关证据支持测定PBMC浓度的价值。但是目前的所有的研究结果均来自单中心、小群体，还需要大型和多中心临床试验来确认这些观察结果。

1.2 组织中药物浓度测定：除研究PBMC 中浓度外，还有不少团队研究了测定移植物细胞中的免疫抑制剂浓度。早在1992 年Sandborn 团队［19］就研究了在肝移植患者（n ＝21）中环孢素在肝细胞组织中的浓度，结果发现细胞中环孢素浓度越低， 排斥反应的可能性越大，而血药谷浓度与排斥反应相关性较差。Hanas 等［20］在肾移植患者中也得到了相似的结论。

对于他克莫司，Sandborn 等［21］测定了肝移植患者中经肝活检确认排斥的患者（n ＝7）与非排斥组（n ＝10）全血与肝细胞中他克莫司浓度， 发现非排斥组肝细胞药物浓度显著高于排斥组， 144 ng/g 比48 ng/g（P ＝0.02）。同时作者提出他克莫司肝组织浓度为100 ng/g 可作为预测排斥的阈值浓度（敏感度：78%，特异性：72%）。但本研究采用了免疫测定法，与他克莫司代谢物有潜在的交叉反应，特别是在肝组织中，因此测定结果可能偏高。Capron 等［22］开发了一种特异性和灵敏度均较高的LC-MS/MS 方法测定肝细胞中他克莫司浓度，其最低定量限为5 pg/mg。共测定146 例 肝移植患者，肝细胞药物浓度范围分布在5 ～ 387 pg/mg，全血药物浓度范围分布为2.7 ～ 19.3 ng/ml。根据BANFF 评分评估排斥反应与全血药物浓度和肝细胞药物浓度的相关性，肝组织药物浓度与其具有显著的相关性。他克莫司细胞浓度＜30 ng/g 预测排斥反应敏感性为89%，特异性为98%。虽然目前的研究结果更支持测定移植物中细胞浓度来预测排斥反应。但是测定移植物浓度需要有创性操 作，在临床推广尚存在困难。

2 游离药物浓度

药物进入体内，部分与血浆蛋白、组织蛋白或体内大分子物质形成复合物，也有部分呈游离状态。只有游离的药物才有药理活性，才能在体内分布和消除，因此监测游离药物浓度比全血总药物浓度能更好地反映疗效。免疫抑制剂蛋白结合率均较高，评估其游离药物浓度与疗效和毒性之间的相关性可能更有临床价值。在血液循环中，他克莫司主要位于红细胞内或与血浆蛋白结合，仅有少于1%的游离药物。Zahir 等［23］在40 例肝移植受者中研究了他克莫司在血液中的分布情况。发现游离他克莫司浓度在发生排斥反应与未发生排斥反应的患者相比具有显著性差异，（0.24±0.08） ng/L 比（0.42± 0.21）ng/L，P ＜0.001，但是两组之间全血总浓度无差异。该研究证实游离他克莫司浓度可以更好地预测临床疗效，但由于复杂的分析技术，作者未进行大样本研究。近几年，有研究建立了操作较简单的LC-MS/MS 方法，将有望进一步推动对游离他克莫司浓度与临床疗效之间关系的研究［24-25］。

除了他克莫司外，还有研究［6］建立了环孢素和霉酚酸游离药物浓度测定的方法学，但未对其临床意义进行评估。Atcheson 团队［27］观察到肾移植患者中血浆白蛋白减少和游离霉酚酸增加 （＞3%）之间存在显著关系，建议低蛋白血症患者应监测霉酚酸游离药物浓度。随后该团队发现 出现血小板较少、白细胞减少或者感染的患者，游离霉酚酸血药浓度-时间曲线下面积（area under concentration-time curve， AUC）值会偏高［28］。Weber 等［29］也得出相似的结论，发现当游离霉酚酸AUC ＞0.4 mg/（h ∙L）时，会增加白细胞减少和感染的风险。因此游离霉酚酸暴露量对预测药品不良反应发生的风险比血浆总浓度更有意义。

3 干纸片法（dried blood spot，DBS）

干纸片法是近年来兴起的一种新型采样方法。患者经简单的培训后可自行在家采集血液滴在采样卡上，晾干，将样品邮寄到实验室进行测定。DBS与传统静脉穿刺抽血相比，无需专业操作，取血量少，比全血更为稳定，便于储存及运输。因此对于需频繁监测免疫抑制剂血药浓度的移植患者具有极大的应用前景。但是在研究过程中发现DBS 在某些患者上并不能达到预期的结果。

Koster 等［30］开发了一种同时分析DBS 样本中他克莫司、环孢素、西罗莫司、依维莫司的 LC-MS/MS 方法。DBS 样品中四种免疫抑制剂在22℃下至少7 d 稳定。血细胞比容对分析结果具有显著影响，追其原因可能是由于红细胞的增加，较高的血细胞比容样品更黏稠，在纸上的渗透性较差。 因此，不同血细胞比容可以形成不同大小的斑点。尽管如此，评估患者静脉全血和静脉DBS 样本之间相关性，r 为0.87，相关性良好，DBS 方法可用作治疗药物监测中全血分析的替代方法。

除血细胞比容外，研究还发现多种参数也会影响DBS 的准确度。Adrian 等［31］共对21 篇有关测定DBS 中免疫抑制剂影响因素的文章进行了分析总结，发现有7 篇（33%）研究了DBS 血斑体积的影响，14 篇（66%）研究了免疫抑制剂在 DBS 中的稳定性，9 篇（42%）研究了血细胞比容的影响，3 篇（14%）研究了血液冲击位置对其的影响。总结发现他克莫司DBS 样本不受血斑体积、血细胞比容、血斑不均匀性和干燥时间的影响，温度对其影响也较小。因此测定他克莫司DBS样本具有可行性。西罗莫司和依维莫司比他克莫司更容易受血细胞容积的影响，Koster 等［32］发现在20%血细胞比容和高分析物浓度（40 μg/ L）时西罗莫司和依维莫司存在显著偏差（分别为-20%和-28%）。两者在高温中稳定性也较差，西罗莫司在60℃下24 h 内出现降解［33］，依维莫司在70℃时在DBS 中不稳定［34］。因此西罗莫司与依维莫司DBS 样品在临床的应用还需要进一步验证。

目前报道的大多数研究是在受控环境中进行的，并且侧重于分析性能。通常由实验室技术人员将静脉样本滴在采样卡上，而不是真正的毛细管取样。结果可能低估了毛细管取样时的因素的影响。Al-Uzri 等［35］评估了家庭采用DBS 监测他克莫司和肌酐的可行性，发现只有80%的血斑符合分析要求，且只有38%的样本是在正确的时间抽取的。一项针对50 岁以上女性人群进行的家庭自我取样的可行性试验报告，发现只有74.1%的样本符合取样标准［36］。因此，DBS 在临床的应用还面临着诸多挑战，仍需进一步对其影响因素进行分析及优化。如何对患者进行培训也是面临的挑战之一。

4 其他生物标本

器官移植患者接受免疫抑制治疗是一个长期的过程，患者需频繁抽取血液测定免疫抑制剂药物浓度。因此寻找一种无创、方便易得、与疗效和毒性相关性较好的基质替代全血药物浓度测定可极大地提高患者依从性和舒适度。目前已有测定唾液、 毛发和胆汁等标本中免疫抑制剂浓度的报道。

Belostotsky 等［37］研究了使用LC-MS/MS 方法测定唾液和全血他克莫司浓度之间是否存在相关性。研究测定了37 例儿童肾移植患者共77 例样本， 结果发现唾液中他克莫司浓度为0 ～ 0.7 μg/L， 血液和唾液中他克莫司浓度之间的皮尔逊积矩相关系数仅为0.36，相关性较差。但Ghareeb 等［38］则得出相反的结论，其测定了46 例成人肾移植受者漱口后唾液样本中他克莫司浓度，其与全血中药物浓度相关系数可达0.71（P ＝0.001）。他克莫司在唾液中的分布具有延迟现象，多变量方差分析显示唾液中的他克莫司浓度与全血中他克莫司浓度、 血浆结合蛋白有关。因此该研究认为测量漱口后唾液中的他克莫司浓度可作为预测全血中他克莫司浓度的可行且非侵入性的方法。Wiesen 等［39］开发了一种LC-MS/MS 方法同时测定唾液和血浆中的霉酚酸及其代谢产物，并在小儿肾移植患者中验证了该方法的适用性，发现霉酚酸唾液和血浆浓度具有良好的相关性。

Müller 等［40］开发了测定环孢素头发样本的分析方法，以评估检测头发中药物含量是否可用于肝移植患者的长期随访。其采集了肝移植术后环孢素治疗患者的毛发样品，通过LC-MS/MS 分析环孢素浓度。结果发现环孢素毛发浓度和其剂量之间的相关性很差。因此采用测量毛发中环孢素浓度替代全血浓度监测可行性不高。

对于肝移植患者在术后一周可能会在胆管放置T 管引流，因此测定术后早期胆汁中药物浓度也是一种无创手段。Boudjema 等［41］建立了LC-MS/MS 测定胆汁中他克莫司浓度的方法，线性范围为 0.5～20 ng/ml，共评估30 例肝移植受者胆汁中的他克莫司浓度与全血浓度之间的相关性。发现经过12 h 胆汁排泄的他克莫司浓度与全血浓度之间没有相关性。Rayar 等［42］评估了41 例肝移植患者他克莫司胆汁中浓度、PBMC 中浓度和全血中浓度之间的相关性。经多变量分析发现他克莫司胆汁浓度与PBMC 浓度具有一定相关性（r ＝0.25，P ＝0.007），PBMC 中浓度和全血中浓度相关性更优（r ＝0.53，P ＜0.001）。同时研究还发现在开始他克莫司治疗开始后第2 天，其胆汁中浓度低于0.20 ng/ml 可作为发生神经毒性的良好预测标志物（AUC ＝0.81）。综上，胆汁中他克莫司浓度与排斥反应和毒性的相关性值得进一步研究，但是胆汁引流仅在部分患者术后早期进行，因此其临床应用存在局限。

5 总 结

非常规样本在免疫抑制剂治疗药物监测中的应用仍处于摸索阶段，虽然目前有不少研究结果显示部分非常规样本与排斥反应有更好的相关性，具有替代全血药物浓度监测的潜力。但是本文提到的数据均来自小样本、单中心的研究，还需要大规模的临床试验进行验证。但是通过对这些非常规样本的研究，可以为我们未来的免疫抑制剂TDM 提供新的思路和方式，我们期待未来可以探索出更好的、适用于临床的TDM 方案。