microRNA-144影响成纤维样滑膜细胞增殖的机制研究

钱 进，龚子臣，张义娜，郑 伟，康 夏 (西部战区总医院骨科，四川 成都 610000)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种可发生于全身各个关节的进行性退化性疾病，高发于老年人。据统计，65岁以上老年人中影像学检查有骨关节炎表现的比例高达60%，80岁以上老年人有骨关节炎的比例高达80%[1]，且骨关节炎具有不可逆转性和高致残性等特点，因此在老龄化加剧的时代会带来沉重的经济负担和社会负担。骨关节炎主要是以滑膜炎症、软骨退化为特征的病变。近年来滑膜病变在骨关节炎中的致病作用日益受到重视，成纤维样滑膜细胞(fibro-like synoviocyte,FLS)是关节滑膜的主要细胞成分，其在骨关节炎发病过程中会出现增殖以及细胞因子表达谱改变等特征，导致纤维化程度加重、软骨细胞凋亡、软骨退化等病变，加重疾病进展，但目前尚不清楚骨关节炎环境下FLS增殖的调控机制。既往研究发现，在增殖活跃的FLS中MDM4表达增高，但其是否调控了FLS的增殖尚待进一步研究[2-3]。另一方面，microRNA-144(mir-144)广泛参与各种细胞的增殖[4-6]，也调控骨关节炎中软骨细胞的凋亡[7]，生物信息学分析发现MDM4可能是mir-144的靶基因。因此，本研究假设mir-144可能通过调控MDM4的表达影响FLS的增殖，探讨mir-144与MDM4之间的调控关系以及两者在炎症环境下对FLS和软骨细胞的调控作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

从C57BL/6小鼠中直接提取原代FLS和软骨细胞，agomir-144、agomir阴性对照(negative control,NC)、antagomir-144、antagomir NC、mir-144 mimics及其阴性对照、MDM4荧光素酶报告质粒及过表达质粒由上海吉马公司设计并合成。DMEM培养基(BI公司，货号：01-052-1ACS)，胎牛血清(BI公司，货号：04-001-1A)，INVI DNA RNA Transfection Reagent (Invigentech，货号：IV1216150)，TRIzol裂解液(Invitrogen，货号：15596026)，cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific，货号：K1622)，SYBR Green PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific，货号：4309155)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，货号：N1610)，CCK-8试剂盒(日本同仁，货号：CA1210-100)，MDM4抗体(Abcam，货号：ab49993)，GAPDH抗体(CST，货号：5174)，Hoechst 33342(碧云天，货号：C1029)，IL-1β(Biolegend，货号：575102)，BrdU细胞增殖检测试剂盒(Biolegend，货号：14246)，Tunel凋亡检测试剂盒(罗氏，货号：12156792910)。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞提取 将10～12周的C57BL/6小鼠滑膜组织取下后剪碎，放入0.1%的Ⅳ型胶原酶中，在37 ℃摇床中消化60 min。然后在振荡器上震荡90 s，将组织悬液以300 g离心5 min，弃上清，将细胞转移至细胞培养瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。将培养后的细胞分为IL-1β刺激组和对照组。在体外模拟骨关节炎环境中，IL-1β刺激组培养基中加入IL-1β(5 ng/mL)刺激12 h，对照组加入PBS，然后收集细胞进行后续检测。

1.2.2 细胞转染 将原代细胞转移至6孔板中，融合度达到70%～80%后，按照INVI DNA RNA Transfection Reagent说明书将agomir-144、agomir NC、antagomir-144、antagomir NC和MDM4过表达质粒转染至FLS中，或将mir-144 mimics和MDM4荧光素酶报告质粒转染至293细胞中。在抑制MDM4表达的实验中，用相同方法转染MDM4-siRNA或其对照siRNA(scRNA)至原代FLS中。

1.2.3 双荧光素酶报告系统检测 收集对数期生长的293细胞，铺于96孔板，每孔约5 000个细胞，约24 h细胞贴壁后，转染mimics NC+MDM4 Wt、mir-144 mimics+MDM4 Wt、MDM4 Wt或mimics NC+MDM4 Mut、mir-144 mimics+MDM4 Mut、MDM4 Mut，按照双荧光素酶报告试剂盒说明检测细胞裂解液中萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性比值。

1.2.4 实时荧光定量PCR 用TRIzol试剂提取总RNA，然后按照说明书方法使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit逆转录为cDNA。实时荧光定量PCR按照SYBR Green试剂说明书方法进行。mir-144的内参为U6，其余目标mRNA的内参为GAPDH。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白印迹检测 用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，SDS-PAGE胶以80 V恒压处理2 h分离蛋白，并用湿转法以80 V恒压处理90 min转移至PVDF膜上，用5% BSA封闭1 h，加入一抗MDM4(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)4 ℃过夜，然后洗去多余一抗，加入二抗山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室温封闭1 h，最后用ECL显影剂曝光。

1.2.6 细胞免疫荧光组化 将处理后的细胞用4 ℃预冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗去甲醛后加入0.5% Triton X-100处理10 min，然后PBS漂洗，滴加含10%驴血清的5%BSA封闭液，在37 ℃下封闭1 h，孵育一抗MDM4(1∶100)；然后洗去多余一抗，室温避光孵育二抗驴抗小鼠Alexa Flour 647(1∶200)，洗去多余二抗，滴加Hoechst 33342(1∶1 000)，室温避光孵育15 min，洗去多余Hoechst 33342。

1.2.7 细胞增殖检测 BrdU检测法：在检测MDM4对细胞增殖的影响时，分别在IL-1β刺激组和对照组中转染scRNA或MDM4-siRNA；而在检测MDM4对miRNA-144介导细胞增殖的影响时，分为agomir NC组、agomir NC+MDM4过表达质粒组、agomir-144组及agomir-144+MDM4过表达质粒组，其中未转染MDM4过表达质粒时转染空质粒作为对照。在收样前2 h加入BrdU溶液(0.5 μL/mL)继续孵育。然后将处理后的细胞用细胞刮刮下，转移至1.5 mL EP管，离心弃上清，按照Phase-Flow BrdU检测试剂盒说明书进行后续步骤，最后通过流式细胞技术检测BrdU阳性细胞比例。CCK-8法：分别转染scRNA(scRNA-NC组)，转染scRNA后用IL-1β刺激(scRNA-IL1β组)，转染MDM4-siRNA(siMDM4-NC组)以及转染MDM4-siRNA后用IL-1β刺激(siMDM4-IL1β组)，其中没有用IL-1β刺激的组用等量PBS替代。将处理后的细胞更换为100 μL培养基，然后每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，孵育2 h后通过分光光度仪检测450 nm波长处吸光度值。

1.2.8 细胞凋亡检测 Tunel法：将处理后的细胞用细胞刮刮下后转移至1.5 mL EP管，离心弃上清，按照罗氏Tunel凋亡检测试剂盒说明书步骤处理细胞，最后通过流式细胞技术检测Tunel阳性细胞比例。

1.2.9 间接共培养检测 按照前述方法将转染后的FLS培养48 h，弃上清，更换为无血清培养基继续培养24 h，然后收集培养基，按照1∶1比例加入到培养软骨原代细胞的培养基中，培养48 h后收样。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 炎症环境促进MDM4在FLS的中表达

通过IL-1β刺激原代FLS模拟炎症环境，然后检测IL-1β刺激组与对照组中MDM4的表达情况，结果显示，IL-1β显著促进细胞核中MDM4的蛋白表达(图1a)，平均荧光强度明显增高(图1b)。收集2组细胞进行蛋白印迹检测发现，IL-1β制激组中MDM4蛋白表达量上调(图1c、d)。

a：细胞免疫荧光组化法检测MDM4在FLS中的表达及细胞内定位；b：MDM4荧光表达强度的定量分析；c：蛋白印迹检测MDM4的蛋白表达水平；d：MDM4和GAPDH蛋白表达灰度值比值 #：P<0.01

2.2 MDM4促进FLS在炎症环境中的增殖

流式细胞术检测结果显示，IL-1β处理后BrdU阳性FLS比例显著升高。在IL-1β刺激组中，用siRNA干预MDM4表达后，BrdU阳性FLS比例显著降低；而在对照组中，用siRNA干预MDM4后，BrdU阳性FLS比例无显著统计学差异(P>0.05),见图2a、b。CCK-8法检测结果显示，IL-1β刺激后可显著提高FLS的增殖能力，而使用siRNA抑制MDM4表达后FLS的增殖能力显著下降，与siMDM4-NC组水平相当。同时siRNA处理后并不能影响scRNA-NC组中FLS的增殖(图2c)。

a：流式细胞技术检测不同刺激情况下BrdU阳性FLS比例；b：BrdU阳性FLS比例的定量分析；c：CCK-8法检测不同刺激条件下各时间点FLS的吸光度值 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

2.3 MDM4是mir-144的靶基因

实时荧光定量PCR检测结果显示，IL-1β显著降低mir-144的表达水平(图3a)。生物信息学分析(TargetScan.org)显示，MDM4 3’UTR端与mir-144存在结合位点(图3b)。进一步通过双荧光素酶报告系统检测显示，mimic mir-144明显抑制了含有MDM4 Wt序列质粒的荧光素酶活性(图3c)；而对含有MDM4 Mut序列质粒的荧光素酶活性无显著影响(图3d)。蛋白印迹检测显示，mir-144过表达会抑制FLS中MDM4蛋白的表达，而抑制mir-144后，MDM4蛋白表达升高(图3e、f)。

2.4 mir-144通过调控MDM4的表达影响FLS的增殖

为进一步验证mir-144通过MDM4调控FLS在炎症环境中的增殖，本研究转染了agomir-144及MDM4过表达质粒，然后用IL-1β刺激体外模拟炎症环境。BrdU增殖检测提示，agomir-144能显著抑制FLS的增殖；过表达MDM4可以促进FLS的增殖，同时能够逆转agomir-144对FLS增殖的抑制作用(图4a、b)。增殖标志物Cyclin D1和CKD2的mRNA表达水平增高，与BrdU结果吻合(图4c、d)。

2.5 mir-144抑制FLS介导的软骨细胞凋亡

实时荧光定量PCR结果显示,mir-144过表达组中MMP-9、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平均降低(图5a～c)。通过用FLS的培养基刺激软骨细胞，Tunel凋亡实验显示，mir-144过表达组培养基处理的软骨细胞凋亡显著下降，而mir-144抑制组培养基处理的软骨细胞凋亡显著增高(图5d、e)。

a：实时荧光定量PCR检测FLS中mir-144的RNA表达水平；b：MDM4 3’UTR端和mir-144的预测结合位点；c、d：双荧光素酶报告系统检测mir-144与Wt、Mut MDM4 3’UTR端的荧光强度比值；e：蛋白印迹检测MDM4的蛋白表达水平；f：MDM4和GAPDH蛋白表达灰度值比值 *：P<0.05；#：P<0.01

a：流式细胞技术检测IL-1β刺激下mir-144干预以及过表达MDM4情况下BrdU阳性FLS比例；b：各组BrdU阳性FLS比例的定量分析；c、d：实时荧光定量PCR检测IL-1β处理的FLS中Cyclin D1、CKD2的mRNA表达水平 *：P<0.05；#：P<0.01

a、b、c：IL-1β处理后FLS细胞中MMP-9、TNA-α、IL-6的mRNA表达水平；d：流式细胞术检测在不同组的FLS条件培养基刺激下，软骨细胞中Tunel阳性的细胞比例；e：对(d)的定量分析 *：P<0.05；#：P<0.01；△：P<0.001

3 讨论

滑膜病变对骨关节炎及类风湿关节炎的病情进展具有重要的调控作用，骨关节炎患者的滑膜中会出现巨噬细胞、辅助性T细胞等多种炎症细胞浸润，IL-17、TNF-α等炎症因子表达也明显增高[8-13]。在这些炎症细胞和炎症因子的刺激下，FLS会出现增殖、侵袭性增强等变化，并释放多种炎症因子及金属基质蛋白酶，导致软骨破坏、软骨细胞凋亡等，最终加重骨关节炎的病情进展[11]。IL-1β是体外模拟关节炎环境的经典炎症因子[12]。本研究使用IL-1β刺激FLS后，其增殖能力明显增强，提示炎症环境能够促进FLS的增殖，这与上述研究结果相符。

目前研究发现FLS的增殖受多条通路的调控，Wnt/β-catenin通路、NF-kappaB通路、SPRY1等均参与其中[14-16]。MDM4是一个原癌基因，能够抑制P53蛋白的抑癌作用，其在多种肿瘤中高表达[17]。MDM4高表达与多种细胞的增殖密切相关[18-21]。研究表明在类风湿关节炎患者的滑膜组织中，MDM4的表达与FLS的增殖呈正相关，但是MDM4是否调控FLS的增殖及其在骨关节炎中的作用尚待进一步研究。本研究发现体外炎症环境下FLS细胞核中的MDM4蛋白表达水平显著增高，抑制MDM4的表达后，FLS的增殖明显降低；而在非炎症环境中，抑制MDM4后FLS的增殖能力无明显改变，说明MDM4主要是在炎症环境中调控FLS的增殖，而在正常环境中对其增殖无显著影响。本研究发现MDM4在正常FLS中的表达水平偏低，因此认为MDM4对正常环境中FLS的增殖调控作用不明显，这可能是因为其蛋白表达未被激活。这一发现证明MDM4特异性调控炎症环境中的FLS，并对FLS的细胞学行为具有重要的影响。

有研究表明，microRNA对FLS及MDM4均有重要的调控作用，mir-155、mir-495、mir-101-3p等均可调控FLS的增殖和炎症因子的释放[22-24]。另一方面，mir-661可以通过下调MDM4的表达而激活P53，mir-1307可以通过调控MDM4介导乳腺癌细胞的顺铂耐药，mir-128可以通过抑制MDM4的表达诱导胰腺癌细胞的凋亡[25-27]。这些研究均提示microRNA是参与滑膜炎症和MDM4表达的重要调控因子。此外，mir-144可通过调控巨噬细胞影响类风湿关节炎的病情进展。本研究也发现炎症环境中mir-144在FLS中的表达下降，结合生物信息学分析发现，MDM4是mir-144的靶基因之一；不仅如此，与MDM4的siRNA作用类似，mir-144也可以通过调控MDM4的表达抑制FLS在炎症环境中的增殖，说明mir-144是FLS在炎症环境中的一个关键的调控因素，MDM4是其重要靶点之一，两者对FLS的增殖均起到了重要的调控作用。

由于MDM4可促进多种金属基质蛋白酶的释放，而mir-144调控了MMP-9、TNF-α和IL-6等多种炎症因子的表达[28-31]，这些因子可直接诱导软骨细胞凋亡并破坏软骨。因此本研究进一步检测了mir-144是否影响这些因子的表达，结果发现mir-144过表达后，FLS中与软骨破坏密切相关的因子(MMP-9、TNF-α和IL-6)水平均明显下降，而软骨细胞凋亡亦受到抑制，提示mir-144能够改变FLS的表达谱，进而改善软骨细胞的凋亡。

综上所述，本研究发现MDM4是mir-144的靶基因，两者的相互平衡对FLS的增殖及表达谱具有重要的调控作用，且mir-144能够通过抑制FLS的增殖和降低软骨破坏相关因子的表达改善软骨细胞的凋亡，mir-144和MDM4可能成为骨关节炎治疗的新靶点，在动物体内和人标本中进一步进行验证有助于深入了解mir-144通过调控MDM4在骨关节炎FLS细胞学行为中的意义及潜在的临床转化应用价值。