延胡索HPLC 法有效成分检测及其不同炮制法研究

杜金茗

（四川省骨科医院，成都 610041）

延胡索属于罂粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W. T. Wang）的干燥块茎，是一种化瘀活血的中药，其味辛、苦，性温，主要应用于胸痹心痛、产后瘀阻、经闭痛经、跌扑肿痛等症状［1］。延胡索主要化学成分为甾体、酚酸、三萜类化合物、生物碱［2］，且近年来随着现代药理学对其不断研究发现，其成分中生物碱活性成分在临床已经逐渐得到明确认识，广泛应用于治疗冠心病［3～4］。此外，延胡索还具有抗炎、镇静、抗肿瘤等作用，同时具有较高的安全性［5～6］。临床治疗中多使用其炮制品，炮制方法主要有酒炙、醋炙等，有研究发现，酒炙延胡索可有效增强其化瘀活血的功效，而醋炙则能止痛疗效、提高行气［7～8］。但关于不同炮制方法对其有效成分含量影响的报道和研究却鲜少。因此，本研究应用HPLC 法对其延胡索乙素、甲素以及脱氢延胡索碱等主要生物碱成分进行检测，并以延胡索乙素、去氢紫堇碱为参考指标，探讨不同炮制方法对其含量的影响，以期为提高延胡索药材质量和优化其炮制工艺提供一定的参考依据。现进行如下报道。

1 仪器与试药

1.1 仪器应用美国安捷伦公司生产型号为1260 的高效液相色谱仪；北京赛多利斯生产型号为BS-210S天平（精密度为0.0001g）；北京实验仪器公司生产CO2真空干燥箱；上海生物科技有限公司生产超声提取仪。

1.2 试药延胡索生品药材均购于胡庆余堂；延胡索乙素对照品（批号：110726）购于中国药品生物制品检定所；延胡索甲素对照品（纯度：98.8%）和脱氢延胡索碱对照品（纯度：99%）均为自制；黄酒选择即墨黄酒，陈醋为山西老陈醋；水选择三蒸水；甲醇、乙腈溶液为色谱纯。

1.3 色谱条件有效成分检测：流动相A 为乙腈，流动相B 为0.2%磷酸溶液，洗脱梯度和检测波长（见表1）；色谱柱为Agilent XDB C18（250×4.6mm，5μm）；30℃柱温；每分钟1.0mL 流速，进样量20μL；不同炮制法检测：流动相为0.1%磷酸溶液：乙腈（28：72），色谱柱为Agilen C18，检测波长为282nm，室温为柱温，每分钟1.0mL 流速，进样量10μL。

表1 流动相洗脱梯度和检测波长

1.4 延胡索不同炮制方法酒炙延胡索：延胡索生品适量，应用20%黄酒进行浸润，待药材完全吸尽酒液后，文火将药材炒干。醋炙延胡索：延胡索生品适量，应用40%陈醋进行浸润，待药材完全吸尽醋液后，文火将药材炒干。醋煮延胡索：延胡索生品适量，应用40%陈醋进行浸润，待药材完全吸尽醋液后，应用武火将药材药液煮沸，文火蒸煮药液，药材将醋液完全吸收后置于CO2真空干燥箱中干燥。醋烘延胡索：延胡索生品适量，应用40%陈醋进行浸润，待药材完全吸尽醋液后，置于CO2真空干燥箱中烘烤40min，温度设置为120℃，之后取出室温下晾干。

1.5 对照品溶液制备有效成分检测：精密称取12.5mg 延胡索乙素对照品、8.0mg 延胡索甲素对照品、6.5mg 脱氢延胡索碱，全部放置入25mL 量瓶并加入甲醇进行溶解，定容后过滤。精密称取去氢紫堇碱、延胡索乙素适量，全部放置入10mL 容量瓶并加入甲醇进行溶解至定容刻度。

1.6 供试品溶液制备有效成分检测：精密称取后应用粉碎机打成粉筛过后放置入平底烧杯中，按照甲醇和浓氨试液以20：1 的比例混合溶液50mL，称定重量，1h 冷浸后1h 加热回流，放冷后称定重量，不足重量应用甲醇和浓氨试液以20：1 的比例混合溶液进行补足，摇匀后滤过。精密称取25mL 续滤液，蒸干后将甲醇加入滤渣进行溶解，更换至5mL 量瓶，稀释至刻度，摇匀后滤过。不同炮制法检测：精密称取后应用粉碎机打成粉筛过后放置入三角锥形瓶中，应用150mL 水溶液进行定量，超声半小时，之后室温静置过滤上层溶液，重复操作2 次，并蒸干超声后滤液，将50mL 水 溶液加入残渣进行溶解，之后加入10mL 浓氨水，连续萃取3次，萃取剂为乙醚溶液，每次30mL，并将3 次萃取液置于烧杯中进行水浴锅蒸干，精密称定蒸干后浓缩品，应用甲醇溶液溶解至定容刻度。

1.7 测定法有效成分检测：精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪进行测定，其代表色谱图见图1、2。

图1 混合对照品（A）HPLC色谱图（1：脱氢延胡索碱；2：延胡索甲素；3：延胡索乙素）

2 结果

图2 延胡索样品（B）HPLC色谱图（1：脱氢延胡索碱；2：延胡索甲素；3：延胡索乙素）

2.1 标准曲线有效成分检测：分别精密称取1、2、3、4、5mL 混合对照品溶液置入5mL 量瓶中，应用甲醇定容后，吸取各溶液20μL，注入液相色谱仪测定峰面积，横坐标为对照品浓度，纵坐标为峰面积。其中YY 标准曲线为Y=21498X-309，r2=0.9999；YJ 标准曲线为Y=22323X-516，r2=1.0000；TJ 标准曲线为Y=20167X-512，r2=0.9996，结果表明，YY 在100μg/mL～500μg/mL、YJ 在64μg/mL～320μg/mL、TJ 在52μg/mL～260μg/mL 范围内峰面积与浓度呈良好线性关系。不同炮制法检测：分别精密称取0.19、0.28、0.37、0.46、0.55mL 混合对照品溶液置入2mL 量瓶中，应用甲醇定容后，吸取各溶液10μL，注入液相色谱仪分析。以延胡索含量与色谱峰面积对应进行回归分析，回归方程Y=2.412×105X-6.14×104，γ=0.995，线性范围为0.19～1.36μg，呈现相关性。

2.2 稳定性有效成分检测：按照2.3 和2.4 的方法进行相关溶液制备，并于制备后0h、2h、4h、6h、8h、24h 以后进行分析，观察溶液稳定性，结果显示24h 内，YY、TJ 和YJ 对照品的RSD 为1.56%、1.97%和1.33%，而供试品的RSD 为0.87%、1.45%和1.56%，说明两者在24h内的稳定性良好。不同炮制法检测：取同一供品溶液，于0h、2h、4h、6h、8h、10h 分析测定延胡索乙素含量，其RSD 为1.88%，说明供试品溶液在10h 内的稳定性良好。

2.3 仪器精密度有效成分检测：连续精密称取混合对照品溶液6 次，每次20μL。结果YY、TJ 和YJ 对照品的RSD 为0.46%、1.10%和0.79%，说明仪器精密度良好。不同炮制法检测：连续精密称取混合对照品溶液5次，每次10μL。结果回归方程的RSD 为0.18%，说明仪器精密度良好。

2.4 重复性有效成分检测：取样品粉末6 份，按照2.4 制备供试品溶液后进样测定，结果YY、TJ 和YJ的含量分别为0.13%、0.07%和0.08%，RSD 分别为1.38%、1.91%和1.75%，说明检测方法重复性良好。不同炮制法检测：取同一批号样品5 份，按照2.4 制备供试品溶液后进样测定，结果RSD 为1.74%，说明检测方法重复性良好。

2.5 回收率试验有效成分检测：取一定量样品，并加入一定量对照品，按照2.3 制备样品溶液进行测定，回收结果见表2。不同炮制法检测：取一定量样品，并加入一定量对照品，按照2.3 制备样品溶液进行测定，回收结果见表3。

表2 脱氢延胡索碱、延胡索甲素及延胡索乙素加样回收率计算结果

表3 延胡索乙素加样回收率计算结果

2.6 样品含量测定有效成分检测：取延胡索药材6批，按照2.4 制备供试品溶液并进行检测，样品含量检测结果见表4。不同炮制法检测：分别取生品、酒炙、醋炙、醋煮、醋烘延胡索，按照2.4 制备供试品溶液并检测其延胡索乙素含量，样品含量检测结果见表5。

表4 延胡索药材有效成分含量检测结果

3 讨论

HPLC 法是目前定量和分离植物中生物碱类成分最有有效的一种方法［9～10］。施菁［11］等通过色谱柱Symmetry C18的使用，流动相A 为乙腈，流动相B 为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长282nm，建立了在白花土元胡药材中检测延胡索甲素、乙素含量的方法。而陈峰阳［12］等则通过Diamonsil C18的使用，乙腈-0.2%醋酸（18：82）的流动相，检测波长为340nm，流速为每分钟1mL，建立了元胡药材中检测脱氢延胡索碱含量的方法。本研究在两者基础上同同时对延胡索中延胡索乙素、甲素和脱氢延胡索碱含量进行检测，该方法重复性好、准确、灵敏，可用于延胡索药材质量控制。

表5 不同供试品中延胡索乙素含量检测结果

中药延胡索因其散瘀、活血、止痛、理气等功效且用药安全在临床应用较为普遍，但多数均以炮制品的形式应用于临床。近年来，随着不同延胡索炮制品在临床应用中各功效较生品延胡索显著增强，不同炮制方法对其有效成分含量的影响逐渐成为医学研究的热点和重点。有研究结果显示，延胡索的炮制方法主要有酒炙、醋炙、醋煮、醋烘等，且酒炙和醋炙两种方法可使得延胡索中延胡索乙素的含量显著升高［13］。本研究中，同样通过酒炙、醋炙、醋煮和醋烘等方法制作延胡索炮制品，并对各炮制品中延胡索乙素的含量进行检测，证实酒炙、醋炙和醋烘方法所得延胡索中延胡索乙素较延胡索生品中延胡索乙素明显更高，这可能与延胡索中生物碱成分大多为游离态形式有关，因其难深于水，经过酒炙和醋炙可增加生物碱盐，从而增加溶解度。相关研究结果也发现，经醋炙所得延胡索的延胡索乙素检出率较生品延胡索高出约20%［14］。而醋煮所得延胡索中延胡索乙素较延胡索生品中延胡索乙素明显更低，究其原因可能是因为蒸煮时间过长，导致延胡索中生物碱结构遭到破坏。

延胡索经传统的酒炙、醋炙、醋烘后，其组织结构得到一定改变，可帮助其有效成分的溶解、沁润、转化和扩散，从而提高延胡索乙素的融出率［15］。延胡索中有效成分的增加使得其药效在疾病治疗过程中相应得到增强，进一步证实延胡索在经酒炙、醋炙、醋烘等方法炮制后临床治疗效果的有效性。

综上所述，HPLC 法用于检测延胡索中有效成分可靠、准确，也是评价其质量的可靠依据，并能在此基础上进行其指纹图谱的研究，且通过超声提取方法提取各延胡索炮制品，操作方式简便，另HPLC 法用于检测延胡索乙素时重复性好、精密度高，采用酒炙、醋炙、醋烘等炮制法可有效增加延胡索有效成分含量。