红凤菜不同器官中黄酮类和奎宁酸类成分的HPLC法测定

鲜 新， 吕 寒， 孟秀花， 马 丽， 刘 艳， 任冰如， 陈 剑

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心， 江苏 南京 210014〕

红凤菜〔Gynurabicolor(Willd.) DC.〕隶属于菊科(Asteraceae)菊三七属(GynuraCass.)，为多年生草本植物，可作为药食两用植物被人们利用。红凤菜全草均可入药[1]，含有丰富的黄酮类、奎宁酸类和萜类等次生代谢产物，具有良好的止血、降血糖和抗氧化等药理活性[2-6]。目前，从红凤菜地上部分已经分离鉴定出多种酚酸类[2，7]和黄酮类成分[8-9]，并对其总黄酮含量进行了分析[10]，但对红凤菜不同器官中黄酮类和酚酸类成分的差异尚缺乏深入了解。

作者采用HPLC法对红凤菜根、茎和叶片中7个黄酮类和奎宁酸类成分的含量进行了比较和分析，以期明确红凤菜的最佳药用部位，为红凤菜资源的合理利用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试红凤菜于2014年引种自海南，现栽种于江苏省中国科学院植物研究所苗圃地，由江苏省中国科学院植物研究所任冰如研究员鉴定。于2019年8月16日采集红凤菜全株1 kg，将根、茎和叶片分开；分别自然阴干，粉碎后过20目筛，备用。

主要仪器和试剂：戴安Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Dionex公司)，GL Science-Inert Sustain C18色谱柱(日本岛津公司)，Mili-QTMAdvantage A10TM超纯水系统(美国Millipore公司)，FG-24固相萃取仪(天津市富城达科技有限公司)，Welchrom®C18E固相萃取柱〔月旭科技(上海)股份有限公司〕。新绿原酸(纯度99%，批号MUST-17011001)对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司；绿原酸(纯度大于98%，批号L-007-160504)、异槲皮苷(纯度大于98%，批号Y-076-180517)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(纯度大于98%，批号S-065-180314)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(纯度大于98%，批号Y-068-160726)和4，5-二咖啡酰奎宁酸(纯度大于98%，批号Y-070-161102)对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；芦丁(纯度大于98%，批号C2/H30016)对照品购自南京春秋生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯或色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 GL Science-Inert Sustain C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相为乙腈(A)和磷酸缓冲盐(B)，梯度洗脱：0～20 min，体积分数90%B；20～25 min，体积分数90%～82%B；25～65 min，体积分数82%B；65～70 min，体积分数82%～75%B；70～75 min，体积分数75%B；75～80 min，体积分数75%～10%B；80～85 min，体积分数10%B；85～90 min，体积分数10%～90%B；90～95 min，体积分数90%B。流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL，芦丁、异槲皮苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷的检测波长为254 nm，新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸的检测波长为325 nm。

1.2.2 对照品溶液制备和标准曲线绘制 精密称取芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、新绿原酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，用甲醇溶解，分别配制成质量浓度为1.990、1.155、1.840、0.752、1.930、1.980和2.590 mg·mL-1的对照品溶液。芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、新绿原酸、绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸按1、10、25、50和100倍进行梯度稀释，异槲皮苷按2、20、50和100倍进行梯度稀释，4，5-二咖啡酰奎宁酸按1、25、250、500和1 000倍进行梯度稀释。按照上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标(Y)、各对照品质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线。

芦丁回归方程为Y=195.940X-0.218(r=0.998 7)，线性范围0.020～1.990 mg·mL-1；异槲皮苷回归方程为Y=43.126X+1.062(r=0.999 3)，线性范围0.016～2.310 mg·mL-1；山奈酚-3-O-芸香糖苷回归方程为Y=160.560X+3.332(r=0.999 4)，线性范围0.018～1.840 mg·mL-1；新绿原酸回归方程为Y=155.930X-0.212(r=0.997 3)，线性范围0.007～0.752 mg·mL-1；绿原酸回归方程为Y=346.460X+0.169(r=0.999 5)，线性范围0.019～1.930 mg·mL-1；3，5-二咖啡酰奎宁酸回归方程为Y=458.480X-8.604(r=0.999 5)，线性范围0.020～1.980 mg·mL-1；4，5-二咖啡酰奎宁酸回归方程为Y=337.230X+23.133(r=0.995 1)，线性范围0.002～2.590 mg·mL-1。

1.2.3 样品提取和测定 分别精密称取根、茎和叶片粉末各3份，每份约2.0 g，各加入体积分数85%乙醇70 mL，回流提取1 h，过滤；将滤液蒸至无醇味，用体积分数50%乙醇超声溶解，蒸干；用体积分数50%甲醇复溶样品，离心，取上清液进Welchrom®-C18E固相萃取柱，用体积分数50%甲醇洗脱；合并洗脱液，用体积分数50%甲醇洗脱，蒸干，用甲醇(色谱纯)溶解，0.45 μm滤膜过滤，定容至5 mL，即为样品溶液。按上述色谱条件进样测定，并根据峰面积和标准曲线计算根、茎、叶样品中7种成分的质量浓度。根据公式“某器官某成分含量=(该器官该成分质量浓度×稀释体积)/该器官质量”计算红凤菜不同器官中各成分含量。

1.2.4 方法学考察 精密度考察：精密吸取7个对照品溶液并混匀，按上述色谱条件重复进样测定5次。各对照品峰面积的RSD值为0.34%～0.81%，表明仪器精密度良好。

稳定性考察：取叶片样品溶液，分别于0、2、4、6、8、12和24 h按上述色谱条件进样测定。各成分峰面积的RSD值为0.67%～1.62%，表明样品溶液在24 h内稳定。

重复性考察：称取叶片粉末5份，按照上述方法制备样品溶液，并按上述色谱条件进样测定。各成分峰面积的RSD值为0.84%～1.87%，表明本方法重复性良好。

加样回收率考察：精密称取叶片粉末1.0 g，分别加入质量浓度0.199 mg·mL-1芦丁、0.231 mg·mL-1异槲皮苷、0.184 mg·mL-1山奈酚-3-O-芸香糖苷、0.075 mg·mL-1新绿原酸、0.193 mg·mL-1绿原酸、0.396 mg·mL-13，5-二咖啡酰奎宁酸和0.259 mg·mL-14，5-二咖啡酰奎宁酸各1 mL，按照上述方法平行制备6份样品溶液，并按上述色谱条件进样测定。计算各成分的加样回收率和RSD值，加样回收率为96.57%～103.60%，RSD值为0.62%～2.24%。

1.3 数据处理和统计分析

采用EXCEL 2016和GraphPad Prism 7软件对实验数据进行处理和方差分析(two-way ANOVA)。

2 结果和分析

红凤菜根、茎和叶片中7个黄酮类和奎宁酸类成分的含量见表1。红凤菜叶片中能检出7个黄酮类和奎宁酸类成分，其中异槲皮苷和绿原酸的含量较高，分别达到4.804和4.041 mg·g-1，芦丁和新绿原酸含量较低；根和茎中仅能检出绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸，新绿原酸和黄酮类成分均未检出。叶片中绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸的含量显著(P<0.05)高于根和茎，茎中这3种成分的含量也高于根，但差异不显著。叶片中绿原酸含量分别为茎和根中的15.7和61.2倍，3，5-二咖啡酰奎宁酸含量分别为茎和根中的16.5和19.9倍，4，5-二咖啡酰奎宁酸含量分别为茎和根的34.9和41.4倍。

表1 红凤菜不同器官中7个黄酮类和奎宁酸类成分含量的比较

3 讨论和结论

植物次生代谢产物对植物的生理活动有重要作用，但同种植物不同器官中次生代谢产物的类型和含量存在差异，如：在长叶榧(TorreyajackiiChun)不同器官中，鞣质和黄酮等次生代谢产物的总含量在叶片中最高，为茎中的7.2倍[11]；在七子花(HeptacodiummiconioidesRehd.)不同器官中，次生代谢产物总含量在老根中最高，且主要为木质素，而叶片中则以黄酮和总生物碱等为主[12]；同样，在红凤菜不同器官中，叶片中黄酮类和奎宁酸类成分的含量最高，显著高于根和茎。由于植物的次生代谢产物合成与其代谢途径、基因表达和调控及生长环境有关[13]，因而，植物次生代谢产物的合成和分布通常在种属、器官、组织以及生长发育期间存在差异。

由于植物不同器官中药用活性成分的类型和含量不同，导致其不同入药部位的药效存在差异。本研究结果表明：在红凤菜叶片中能检出7个黄酮类和奎宁酸类成分，而在根和茎中只能检出3个奎宁酸类成分，且叶片中黄酮类和奎宁酸类成分含量均较高，因此，从药用成分角度考虑，建议选择红凤菜叶片作为药用部位。

本研究仅以产自南京的红凤菜为研究材料，由于药用植物的药效还与其生境、物候期及栽培管理措施等因子密切相关，因而，后续将以不同产地、不同季节的红凤菜为研究对象，进一步明确红凤菜次生代谢产物合成和积累的影响因子，为其药用资源的有效利用提供基础研究数据。