从光雷,刘 青,孙 伟,曾申明
(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009)
精液保存是人工授精最重要的技术环节之一,保存方式有液态(0℃以上)和冷冻(0℃以下)2 种。液态保存有常温和低温保存,其原理是通过缓慢降低温度(0℃以上)使精子的运动和代谢速率降慢来延长精子体外存活时间,同时不丧失受精能力。目前,在绵羊精液冷冻保存尚难在生产中推广的情况下,精液的液态保存有很大的实用价值,且使用时需用设备简单、操作方便。冷冻保存在绵羊生产中尚未推广开,主要是因为精子在冷冻过程中会遭受到物理性、化学性和氧化性损伤,导致其活力和受精能力下降。精液无论是液态还是冷冻保存,在处理和保存过程中都会产生活性氧化物,它们能破坏精子膜结构,对精子质量造成有害影响。目前主要是在稀释液中添加抗氧化剂来降低氧化应激对精子造成的损伤,但各研究结果不尽一致,需要进一步深入研究和分析。此外,单独添加某种抗氧化剂的研究较多,联合添加较少,因此需对各种类型抗氧化剂深入了解,才能改进现有的稀释液或开发出新型稀释液。本文根据国内外最新进展,全面综述抗氧化剂在绵羊精液保存中的研究和应用现状,为新型稀释液的研究提供参考。
活性氧(ROS)包括超氧阴离子(O2-)、超自由基(-OH)和过氧化氢(H2O2)等。适量ROS 对维持精子正常的生理功能是必要的,如生理功能的调节、结合透明带能力的提升等[1]。此外,ROS 在精子获能过程中发挥重要作用,当精液中过氧化氢含量下降到一定水平后,精子将不能发生获能。但ROS 过量就会造成精子DNA 碎裂、质膜损伤、线粒体功能异常和调亡等,最终缩短精子在体外存活时间[2]。对于绵羊而言,ROS主要由精子的芳香族氨基酸氧化酶(AAAO)催化产生,这种酶主要来自死精子。如果精液中死精子越多,这种酶活性越强,从而造成恶性循环,导致某些仍有活力的精子因为ROS 浓度升高而受到损害[3]。
活性氧化物还有一类含氮化合物,统称为活性氮(RNS)。它们是O2-与其他的自由基反应生成,包括一氧化氮(NO-)、二氧化氮(NO2-)和过氧化亚硝酸盐(ONOO-)等。正常男性精液中NO-浓度显著低于弱精子症患者,NO-浓度与精子活力呈显著线性负相关,NO-浓度与精子活力运动参数(曲线及直线运动等)亦呈显著线性负相关[4]。以上研究表明,自由基产生过多或暴露在氧化环境下会降低精子直线前进运动率。但适宜的NO-浓度能促进精子获能,所以NO-对精子的生理作用可能依赖于其氧化还原状态及浓度。
绵羊精液和精子本身具有抗氧化机制,包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶,以及非酶抗氧化剂,如蛋氨酸、抗坏血酸和生育酚。但精子合成上述物质的能力有限,同时在精液处理和保存过程也会产生ROS 和RNS。为了降低氧化物对精液品质的影响,通常会在稀释液中添加外源抗氧化剂来改善精子质量。
精液无论是液态还是冷冻保存,在处理和保存过程中都会产生活性氧化物,它们能破坏精子膜结构,对精子质量造成有害影响。目前,生产应用中液态保存下添加不同类型的抗氧化剂是主要策略。因为冷冻保存精液的过程会造成精子冰晶化产生活性氧化物,对精子伤害大于液态保存。因而,近年来在冷冻保存中添加抗氧化剂的研究较多。
3.1 酶 新鲜精液中超氧化物歧化酶含量最高,是主要活性酶。调控精子中过氧化物浓度的酶系统由谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽合成和还原所需的几种辅酶组成。谷胱甘肽过氧化物酶作用于谷胱甘肽将过氧化氢还原为水,脂肪酶还原为烷基醇。而谷胱甘肽还原酶在氧化应激下又能诱导谷胱甘肽从氧化态转化为还原态。Kasimanickam 等[5]报道,质量较差的精液中谷胱甘肽过氧化物酶活性较高,而超氧化物歧化酶活性与精液质量无关。Marti 等[6]报道,绵羊精液在15℃保存6 h后,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性保持不变;精液冷冻保存时,谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性保持稳定,但超氧化物歧化酶活性约下降一半。然而,精液冷冻保存中添加超氧化物歧化酶的研究结果存在争议。Mohsen 等[7]发现在精液冷冻保存中添加150 μmol/L 超氧化物歧化酶能保护精子质量;Silva 等[8]在精液冷冻保存中添加超氧化物歧化酶(25、50、100 U/mL)并未发现精子运动参数有明显增强,但添加100 U/mL 能保持精子顶体的完整性,并增强对线粒体的保护。
过氧化氢酶是酶类抗氧化剂,又称触酶,能使过氧化氢分解为氧和水,阻断氧化反应,从而保护精子免受过氧化氢的损伤。液体保存中添加100、200 U/mL 过氧化氢酶均能降低冻融对精子运动性能的影响,但过氧化氢酶浓度大于200 U/mL 会对精子产生毒性[9]。
谷胱甘肽具有抗氧化作用,对精子起到保护作用。绵羊精液在液体保存时,添加谷胱甘肽对精子的总运动性能未见影响。在冷冻保存中添加5 mmol/L 谷胱甘肽会导致精液中谷胱甘肽过氧化物酶活性增加,但对脂质过氧化和精子运动性能未见影响[10]。Silva 等[8]研究发现,在绵羊精液冷冻保存中添加2.5 mmol/L 谷胱甘肽对精子的运动性能未见影响,然而添加7 mmol/L 谷胱甘肽会导致精子直线前进运动降低。因此,精液稀释液中是否需要添加谷胱甘肽还需进一步研究。
3.2 维生素 在正常精液和精子中,维生素E 是主要的亲脂性抗氧化剂,在质膜中含量丰富,能保护精子中多不饱和脂肪酸免受过氧化。有报道在绵羊精液液态保存稀释液中添加1 mg/mL 维生素E 能提高精子直线前进运动率[11]。Kheradmand 等[12]报道,在绵羊精液冷冻保存中添加1 mg 或2 mg 维生素E 能提高精子运动性能和膜完整性。
奎诺二甲基丙烯酸酯是一种类似维生素E 的水溶性抗氧化剂,具有清除脂质过氧自由基的功能。精液液态保存时添加奎诺二甲基丙烯酸酯对绵羊精液的脂质过氧化有保护作用[13],而Mata 等[14]研究指出,添加奎诺二甲基丙烯酸酯对精子质量有害。冷冻保存液中添加60、120 μmol/L 奎诺二甲基丙烯酸酯对精子质膜完整性和运动性能有益[15],而Maia 等[16]报道,冷冻保存中添加奎诺二甲基丙烯酸酯(50 mol/108精子)对精子质膜完整性和活力未有增加。综上说明,奎诺二甲基丙烯酸酯添加效果可能与稀释液相关组成成分有关。
抗坏血酸是一种水溶性维生素,对人体至关重要,抗坏血酸与生育有关,但其在生殖生理学中确切作用尚不确定。Choucair 等[17]推测抗坏血酸可能是通过阻止氧化损伤来保护精子DNA 完整性。Azawi[11]在5℃保存Awassi 羊精液中添加0.9 mg/mL 抗坏血酸能提高精子运动性能。Sánchez-Partida 等[18]报道,在绵羊冷冻保存中添加50、100 mmol/L 抗坏血酸时,冻融精子比对照组的直线前进运动率降低。Rietjens 等[19]、Amidi 等[20]报道,抗坏血酸在过渡金属离子存在时可促氧化活性,当亚铁离子存在时,抗坏血酸将Fe3+转化为Fe2+,Fe2+与氧或过氧化氢反应生成羟基自由基,引发脂质过氧化。而稀释液中含有多种无机盐时,Fe3+会从乳铁蛋白中释放出来[21]。因此导致精子活力降低。
维生素B12是一种水溶性维生素,在许多生化反应中起辅酶作用。Asadpour 等[22]报道,在液态和冷冻保存液中添加维生素B12(2 mg/mL)能提高杂交羊和Dallagh 羊精子运动性能。哈福等[23]研究指出,冷冻保存液中添加维生素B 复合物(3% v/v)能提高精子运动性能膜完整性。
3.3 氨基酸 正常精液或精子中的氨基酸具有抗氧化功能,通常精液中存在高浓度的氨基酸。精液保存液中主要添加的氨基酸有谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、麦角硫氨酸、牛磺酸和脯氨酸等。半胱氨酸和谷胱甘肽能维持精子质量、保护精子质膜和顶体完整性;麦角硫因是单线态氧羟基自由基和过氧自由基的清除剂,有利保护精液DNA 完整和提高精子总运动力;蛋氨酸具有保护细胞免受氧化损伤的作用,是谷胱甘肽的前体氨基酸,在解毒过程中发挥重要作用。牛磺酸是主要的非酶清除剂之一,能够防止精子脂质过氧化和精子活力的降低;牛血清白蛋白能保护精子质膜完整性,也是酶的稳定剂,防止酶的分解和非特异性吸附,减轻有些有害环境因素的影响。
半胱氨酸是一种含巯基的氨基酸,参与谷胱甘肽的合成。精液冷冻保存液中添加10 mmol/L 半胱氨酸比其他浓度(0、5、20 mmol/L)更能保护精液质量[24],添加半胱氨酸(1、5、10 mmol/L)还能提高精子运动性能和质膜完整性[25-26]。
精液的液态保存液中添加蛋氨酸(1、2、4 mmol/L)能提高精子总运动力、直线前进运动率和线粒体活性[27]。Bucak 等[28]研究指出,精液冷冻保存液中添加5 mmol/L谷氨酰胺能提高精子运动能力和质膜完整性。Mehr 等[29]也验证了这一结果,稀释液中添加L-谷氨酰胺(40、80 mmol/L)能提高精子总运动力、直线前进运动及顶体和质膜完整性。
麦角硫因是一种重要的低分子量硫醇,它是单线态氧羟基自由基和过氧自由基的清除剂,有利保护精液DNA 完整。Coyan 等[27]报道,与对照组相比,冷冻保存中添加麦角硫蛋白(2、4 mmol/L)提高了精子总运动力和直线前进运动率。Abozar 等[30]报道,冷冻保存液中添加6 mmol/L 麦角硫因能提高精子总运动力、直线前进运动率和质膜完整性,并降低脂质过氧化。
牛磺酸是一种磺酸氨基酸,存在于附睾和输卵管液中,是主要的非酶清除剂之一。Saleh 等[31]报道,液态保存液中添加牛磺酸能保护精子免受活性氧和脂质过氧化影响。冷冻保存液中添加牛磺酸能提高精子运动性能和膜完整性[18,32]。Sangeeta 等[33]报道,冷冻保存精液时添加L-谷氨酰胺和L-脯氨酸的卵黄稀释液,能够提高精子的总运动力,使羊附睾精子的质膜和顶体完整性优于对照组。
牛血清白蛋白能保护精子质膜完整性,也是酶的稳定剂,可防止酶的分解和非特异性吸附,减轻一些不利环境因素的影响。此外,稀释液中添加10%、15% 牛血清白蛋白能替代卵黄,并能在冻融过程中提高精子的直线前进运动率[34-35]。
3.4 植物提取物 植物(香合子、厚朴、山茶花等)的提取物可用来提高精液质量,例如丁香富含酚酸、黄酮醇甙、酚类挥发油(丁香酚、乙酰丁香酚、异丁香酚)和单宁,这些物质具有清除自由基和螯合重金属的功能。Baghshahi 等[36]报道,与冷冻保存液中添加0、115 μg/mL丁香花蕾相比,添加35、75 μg/mL 丁香花蕾提高了精子运动性能。同样,冷冻保存液中添加4%、6% 迷迭香水提取物能提高精子总运动力、直线前进运动率和质膜完整性[37]。
除了丁香和迷迭香之外,绿茶含有多种生物活性的化合物,如多酚、儿茶素、表儿茶素、没食子酸酯和没食子儿茶素-3-没食子酸酯,这些都具有清除自由基的功能。冷冻保存液中添加绿茶提取物能保护精子免受氧化应激的损伤[38]。
大豆卵磷脂是通过稳定和替代磷脂来保护精子膜,从而增加对冷冻过程的耐受性。精液冷冻保存液中添加1.5% 大豆卵磷脂能提高精子质量[39],然而精液5℃保存液中添加3.5%大豆卵磷脂会导致运动性和线粒体活性降低[40]。
近期研究表明,精液冷冻保存中添加少量摩洛哥坚果油和仙人掌籽油能提高精子总运动力、直线前进运动率和质膜完整性,并且降低了脂质过氧化(自发和诱导)和DNA 损伤。精液的液态保存液中添加1%仙人掌榕提取物,也得到了类似结果[41]。
3.5 其他复合物 近年还有许多复合物用来延长精液保存,例如白藜芦醇、蜂王浆、丁基化羟基甲苯、番茄红素、虾青素等。据报道,白藜芦醇和槲皮素分别是具有抗氧化活性的非黄酮类和黄酮类多酚。在精液保存中添加白藜芦醇或槲皮素(5~20 μg/mL)能提高精子直线前进运动力[8];稀释液中添加(15 μg/109精子)白藜芦醇可抑制精子脂质过氧化[42]。
蜂王浆主要成分是蛋白质,其次是糖类、氨基酸、核酸和脂肪酸等,具有多种生理和药理作用。精液保存中添加蜂王浆(0.5%、1.0%)能提高精子运动性能和质膜完整性[43]。在精液保存中,蜂蜜、大蒜(大蒜属)和脱脂奶混合使用能显著提高精子总运动力[44]。
丁基化羟基甲苯是一种合成酚类抗氧化剂,通过提供氢原子来抑制自由基链反应,能有效地抑制脂质过氧化。稀释液中添加丁基羟基甲苯(0.5、2.0 mmol/L)能提高精子质量,降低脂质过氧化[45]。Farshad 等[46]研究发现,冷冻保存液中添加2 mmol/L 丁基羟基甲苯能提高精子总运动力、直线前进运动率和质膜完整性。
咖啡因具有促进精子运动能力和提高精子质量的功能。Špaleková 等[47]报道,在精液保存中添加4 mmol/L咖啡因能提高加鲁特公羊精子质量。Kubovičová 等[48]报道,在冷冻保存稀释液中添加咖啡因对精子总运动力具有积极作用,能维持精子运动性能和减少精子凋亡。
液体保存液中添加明胶能提高精液质量。Meque 等[49]在精液保存中添加不同浓度的明胶(0.5%、1%、2%和4%),结果发现最有效的浓度为0.5%。Yániz 等[50]报道,15℃精液保存液中添加明胶能提高精子的总运动力和受精能力,表明明胶作用机制可能是使精子更均匀地分布,防止死、活精子凝集沉淀,从而最大限度减少pH 和有毒代谢产物对精液的影响。
虾青素是一种强效的脂溶性红色类胡萝卜素,它是在某些海洋植物中发现,是自然界中最强大的抗氧化剂之一。精液保存中添加虾青素能保护精子质膜完整性,提高精子的总运动力[51]。
番茄红素是番茄和红色水果中最丰富的类胡萝卜素,是所有类胡萝卜素中最有效的抗氧化剂。Peker 等[52]报道,5℃精液保存液中添加番茄红素能提高绵羊精子总运动力和线粒体活性,同时降低氧化应激。Uysal 等[24]报道,精液冷冻保存液中添加番茄红素能提高精子的总运动力。
角黄素是在植物、绿藻、细菌、甲壳类动物、鱼类和鸟类中发现的一种类胡萝卜素。已经报道称精液冷冻保存液中添加角黄素(10、25 μmol/L)能提高精子运动性能[53]。
褪黑激素是松果体分泌的一种激素,也是一种内源性抗氧化剂,但在绵羊精液保存中研究稀缺。褪黑素对哺乳动物精子功能的维持有良好的作用,可以改善精子的形态特征[54]。Ashrafi 等[55]研究表明,在冷冻稀释液中添加褪黑素可以降低牛精子冻融过程的不利影响。褪黑素对精子的保护作用与降低脂质过氧化有关,也可能与提高抗氧化能力和抗氧化酶活性有关。褪黑素能够促进几种酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶)的活性,这几种酶参与ROS 的代谢,能够保持细胞膜的流动性。Li 等[56]报道,在水牛精子冷冻保存时添加褪黑素能降低精液处理和冻融对水牛精子的影响。Martín-Hidalgo 等[57]观察到,野猪精液17℃保存中添加1 μmol/L 褪黑素除了改善精子中顶体完整的比例外,并没有改善精子功能(保存7 d)。Succu 等[58]报道,褪黑素对公羊精子低温保存的保护作用取决于褪黑素浓度。因此,在绵羊精液保存中添加褪黑素有待进一步研究。
丙酮酸在精液保存中常作为能量物质来添加,但其也具有抗氧化作用。通过丙酮酸能引起芳香族氨基酸氧化酶活性的增强,从而产生抗氧化作用。其作为抗氧化剂添加到绵羊精液稀释液中的报道稀少。Upreti 等[59]报道,绵羊精液释液(RSD-1)中添加丙酮酸钠(5 mmol/L)具有抗氧化剂作用。
绵羊精液保存(液态或冷冻)时经过一系列处理,精子不可避免地产生活性氧,导致质膜受到损伤和精子质量下降。因此,多年来人们一直尝试在稀释液中添加抗氧化剂来清除精液保存中产生的活性氧,从而延长精液保存时间和精子质量,但研究结果不尽一致,还需要进一步深入研究和分析;此外,单独添加某种抗氧化剂的研究较多,联合添加的研究较少;需要对不同种类抗氧化剂进行深入了解,才能改进现有的稀释液或开发出新型稀释液。