热应激对猪禽肠道健康的影响及其机制研究进展

熊云霞，王 丽，易宏波，蒋宗勇

（广东省农业科学院动物科学研究所，农业部华南动物营养与饲料重点实验室，国家畜禽育种重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州 510640）

恒温动物存在一个最适生长环境温度范围，当外界温度过高，超过上限，机体难以通过神经内分泌系统自主调节，就会出现行为和生理代谢异常、机体损伤等现象，即热应激反应。随着全球气候变暖及畜禽养殖产业集约化生产模式的发展，猪、鸡、鸭等普遍为大规模笼养、圈养，在热带、亚热带地区，热应激成为影响畜禽夏季生产性能的重要因素，主要表现为畜禽采食量降低[1]、生长放缓、饲料转化率降低、抗病能力减弱，甚至出现个体死亡，给畜牧业带来巨大的经济损失。早期有关畜禽热应激的研究主要集中在对动物行为、生产性能、生理生化指标的影响等方面，而近年来的研究主要针对采食、肠道健康和机体免疫的影响及机理展开工作。肠道作为机体营养物质消化吸收的主要位点、免疫防御的第一道屏障，不可避免地成为畜禽热应激研究的首要热点。有研究发现，热应激导致畜禽胃肠道消化吸收功能降低，黏膜通透性增加，有害物质迁移、易位，诱发机体免疫反应，菌群结构失衡，屏障功能受损[2-5]。本文从消化吸收功能和屏障功能两方面综述有关热应激对猪禽肠道健康的影响及其机制的最新进展，为生产实践提供一定的理论参考。

1 热应激对猪禽肠道消化吸收功能的影响

1.1 热应激对肠道消化功能的影响 恒温动物降低采食从而降低消化代谢产热，是机体应对高温环境的有效策略。温热环境下，机体散热能力有限，通常会导致体温升高。动物采食中枢下丘脑弓状核的抑食神经元前黑素细胞皮质素原（Proopiomelanocortin，POMC）可表达高温感受器-瞬时受体电位离子通道V1（Transient Receptor Potential ion Channel V1，TRPV1），热信号激活TRPV1 进而激活抑食神经元POMC，抑制采食[6]。同时热应激影响肠道食欲肽的分泌，肠道组织中胆囊收缩素（Cholecystokinin，CCK）基因表达显著升高，CCK 可刺激抑制胃排空的迷走神经纤维，进而通过采食中枢调控抑制采食和胃排空，延缓食物继续进入肠道。消化过程分为物理消化和化学消化。研究发现，高温环境下，机体肠道蠕动变慢[7]，胃肠道消化酶分泌减少、活性降低。Pearce 等[8]研究发现，温热环境下猪的空肠食糜淀粉酶和胰蛋白酶活性等显著降低，回肠蔗糖酶和麦芽糖酶分别降低30% 和24%。综上，热应激条件下机体采食、消化同时受到中枢神经和肠道内分泌的调控。而生产实践发现，热应激畜禽在天气突然变凉爽后并不能立即恢复采食，而是存在1 周左右的延迟时间，可能是受损胃肠道的修复时间。因此可以认为，短时间热应激对采食的影响应该主要考虑中枢神经的调控作用；而长时间的热应激应综合考虑中枢调控和肠道内分泌的作用，且应着重考虑整个肠道的健康状况。

1.2 热应激对肠道吸收功能的影响 肠绒毛是小肠的主要黏膜结构，是营养物质吸收的主要部位。肠绒毛越长越发达，小肠与营养物质的接触面积越大，营养物质吸收能力越强。而肠绒毛高度受隐窝干细胞增殖、幼稚上皮细胞迁移以及成熟上皮细胞凋亡脱落的共同影响，绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度比值（The Ratio of Villi Height to Crypt Depth，V/C）可作为衡量动物肠道健康的重要指标[9]。利用肠道组织切片染色技术，经光学显微镜直接观察温热环境下肠道黏膜形态结构的变化情况发现，热应激导致畜禽肠绒毛顶端破裂，黏膜上皮脱落，固有层裸露形成溃疡，肠腺萎缩，且显著水肿，各肠段V/C 出现不同程度降低，整个肠道黏膜形态结构损伤严重[10-12]。热应激导致肠绒毛上皮细胞中促凋亡因子半胱天冬酶3（caspase-3）、半胱天冬酶8（caspase-8）、半胱天冬酶9（caspase-9）、B 淋巴细胞瘤2 关联X 蛋白（B cell lymphoma 2-Associated X，Bax）等表达上调，抗凋亡因子B 淋巴细胞瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表达下调导致[13]，最终导致了肠绒毛的凋亡脱落。从蛋白组学层面分析热应激条件下肠道黏膜的差异蛋白的研究发现，下调的蛋白主要集中在三羧酸循环、电子传递链和氧化磷酸化等通路，说明热应激导致畜禽肠道黏膜细胞的能量代谢紊乱和线粒体氧化应激[14]。通过透射电镜观察热应激大鼠空肠组织的超微结构也发现，热应激导致细胞线粒体出现肿胀、空泡化等现象[15]，提示热应激导致肠道上皮细胞损伤可能与线粒体凋亡途径有关。热应激引起细胞DNA 氧化损伤[16]，导致组织或者血液中的氧自由基、抗氧化酶活性显著变化[17-20]。因此，热应激导致的细胞线粒体氧化应激是肠道绒毛结构损伤的原因之一，线粒体氧化应激促使畜禽肠道上皮细胞出现凋亡、坏死、脱落。这也解释了饲料中添加一定量的硒、维生素C、维生素E、黄酮等抗氧化剂可一定程度缓解热应激造成的畜禽肠道损伤。另一方面，热应激使得肠道黏膜损伤细胞修复受阻。研究表明，热应激影响了丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）介导的细胞损伤修复过程[11]，且高温环境下肠道表皮生长因子（Epithelial Growth Factor，EGF）及其受体的表达显著下调，阻碍肠道上皮细胞的增殖再生[21]。Yu 等[22]也发现，热应激通过介导细胞外信号调节蛋白激酶1/2（Extracellular-Regulated Kinase 1/2，ERK1/2）途 径调控肠道上皮细胞的存活、增殖和迁移，温热环境下肠道细胞ERK1/2 磷酸化蛋白表达显著上调，进一步改变与增殖、分化、生长相关基因mRNA 的表达。

温热环境对畜禽肠道吸收功能的影响还表现在机体对营养物质选择性偏好的改变。热应激条件下葡萄糖转运能力和血糖浓度升高，空肠钠-糖共转运载体1（Sodium-Dependent Glucose Transporter 1，SGLT-1）表达可提高大约50%[23-25]。有研究发现，热应激条件下，氨基酸转运载体rBAT、y+LAT1、CAT1基因的mRNA表达均显著降低，对蛋白质物质的吸收能力降低[26]。因此，热应激条件下，机体偏好吸收糖类物质而非蛋白质。机体温度升高后，机体血液会更多地流向外周组织散热，导致肠道血流量减少[27]。Hall 等[28]把接受动脉注射细胞低氧标记[3H]米索硝唑的大鼠暴露在高温环境下，发现在小肠内的[3H]米索硝唑滞留高达29%。脯氨酸-4-羟化酶可羟基化缺氧标记物缺氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF）的功能亚基，使其保持非活性状态，Pearce 等[29-30]研究发现，热应激条件下畜禽肠道脯氨酸-4-羟化酶β含量较低，导致HIF活性升高。提示在热环境下，畜禽肠道组织缺血缺氧。而这正可能是造成机体偏好吸收糖类物质，进而通过糖酵解途径获得能量的原因。

2 热应激对猪禽肠道屏障功能的影响

肠道通过腔管状结构将肠道内物质与机体内环境有效分开，吸收肠腔内水分和营养物质的同时，防止有害大分子、内毒素、病原菌等入侵，发挥屏障功能。根据组成和功能，可将肠道屏障划分为机械屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障[31-32]。热应激导致肠道形态损伤，肠道屏障的结构基础遭到破坏，肠道通透性增加，屏障功能受损。

2.1 热应激对肠道机械屏障的影响 肠道黏膜上皮细胞之间通过紧密连接、黏附连接和桥粒来维持细胞的正常结构。紧密连接是多种蛋白相互作用形成的复合体，是决定细胞通透性的主要因素，包括跨膜蛋白如闭锁蛋白（Occludin）和闭合蛋白家族（Claudins）、膜周蛋白如闭合小环蛋白（ZO-1）以及细胞骨架肌动蛋白和肌球蛋白[33]。热应激导致畜禽肠上皮细胞跨膜电阻降低，通透性增加，肠道完整性遭到破坏[8,27]，这与紧密连接蛋白的表达和分布变化有关。相关的畜禽肠道黏膜蛋白组学研究表明[14-15]，热应激导致的差异蛋白主要参与细胞结构及流动性、葡萄糖及能量代谢、应激应答与防御、细胞增殖和凋亡等生物学过程；信号通路分析发现，主要富集于细胞骨架、细胞流动性、紧密连接、MAPK 等相关通路；且进一步WB 验证表明，热应激激活MAPK、NF-κB 通路，降低紧密连接蛋白Occludin、ZO-1、钙粘附蛋白E（E-cadherin）等的表达。过高的环境温度可升高肠道上皮细胞中磷酸化蛋白激酶（Protein Kinase C，PKC）、磷酸化肌球蛋白轻链激酶（Myosin Light Chain Kinase，MLCK）、磷酸化肌球蛋白轻链（Myosin Light Chain，MLC）等蛋白的表达，而MLC 磷酸化可诱导肌动球蛋白互作，进而调控细胞骨架蛋白收缩，使得紧密连接被打开，肠道通透性增加[34]。

短时间温和热刺激下，为维持细胞正常屏障功能，肠道上皮会上调MLCK、酪蛋白激酶Ⅱ-α蛋白（Casein Kinase II-α，CK II-α），出现热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）和热休克转录因子-1（Heat Shock Transcription Factor，HSF-1）介导的ZO-1、Claudin 3 和Occludin 蛋白等代偿性升高[23,35-36]。这与畜禽在限饲或者营养匮乏条件下，肠道上皮细胞出现代偿性增殖的结果一致[37-38]。有研究表明，采食量降低（限饲或者低营养摄入）可引起畜禽肠道绒毛长度变短、形态受损、黏膜完整性降低[37-39]。热应激导致畜禽采食量显著降低，提示采食量降低可能是肠道黏膜机械屏障损伤的原因之一。

Pearce 等[23,29-30]在畜禽热应激试验中设置常温环境配对饲喂组（即常温条件下，采食量与热应激组相同）用来消除不同采食量的交互影响，结果发现低营养摄入导致的肠道结构损伤与热应激相似，都出现肠道完整性降低和血液内毒素浓度升高的现象，但是两者的蛋白和mRNA 谱图有巨大差异，热应激导致了281 个蛋白表达差异，而采食降低只造成20 个蛋白差异表达。并且热应激导致机体体温升高，易使肠道缺血缺氧，肠道局部产生并积累大量酸性代谢产物，引起细胞酸中毒从而导致细胞代谢障碍和组织损伤；同时缺氧导致三磷酸腺苷耗尽，改变肠道上皮细胞离子泵活性，细胞外Ca2+内流增加，加重细胞组织水肿，促进肠道通透性增加[2-3]。因此，热应激导致的肠道损伤不应只考虑采食降低这个因素，应该综合考虑机体体温升高时肠道缺血缺氧的情况。

此外，热应激可显著增加畜禽肠道中的肥大细胞数目[12]，而肥大细胞可释放类胰蛋白酶和组胺等物质增强上皮组织通透性。因此，温热环境增加肠道通透性可能还与肥大细胞增多有关。

2.2 热应激对肠道化学屏障的影响 化学屏障指的是覆盖在肠道上皮表面的肠液，包括肠道上皮细胞和黏膜下腺体分泌的黏液、消化液以及肠道菌群产生的抑菌物质等，肠液的主要化学成分包含黏蛋白（Mucin，MUC）、溶菌酶、防御素、胃肠消化酶、胆汁、胃酸、抗菌肽等，肠液可润滑肠道并抑制有害菌黏附、定植，维护肠道健康。长时间高温高热使得畜禽肠道黏膜出现溃疡性坏死脱落，腺体结构被破坏，杯状细胞数量下降导致黏液分泌不足[12]，胃肠道消化酶分泌减少，肠道菌群组成改变[26]，造成肠道黏液减少、成分改变，从而影响肠道的化学屏障功能。目前，热应激对畜禽肠道化学屏障的影响还未受太多关注，需要进一步研究。

2.3 热应激对肠道免疫屏障的影响 热应激造成的肠道免疫反应主要是指肠道形态及屏障损伤造成的内毒素及病原菌易位引起的肠道炎症反应。肠道黏膜免疫系统主要包括肠道相关淋巴组织和分泌型抗体，其中肠道相关淋巴组织包括肠黏膜相关淋巴组织、弥散性淋巴组织，而分泌型抗体以分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin，sIgA）为代表。可以通过测定肠道上皮内淋巴细胞数量及分布、sIgA 含量及检测T淋巴细胞亚群来评价肠道的免疫状态。温热环境下，畜禽各肠段的肥大细胞数目增加[12]，肠道sIgA 含量显著降低[40-41]；肠黏膜中病原识别受体Toll 样受体2（Toll-Like Receptors 2，TLR2）、TLR4表达显著下降；细胞抗炎症因子干扰素-γ（Interferon，IFN-γ）、白细胞介素-2（Interleukin-1，IL-2）、IL-4、IL-10mRNA 转录显著降低；且肠系膜淋巴结中抗原识别细胞CD3+T、CD3+CD4+CD8-T 显著降低，而CD3+CD4-CD8+T 细胞显著升高。进一步通过基因芯片技术发现，热应激通过介导酪氨酸激酶-转录因子（Janus Kinase-Signal Transducer And Activator Of Transcription，JAK-STAT）通路使得抗原呈递改变，导致畜禽肠道的免疫应答功能减弱[41-42]。病原体逃脱肠道免疫系统屏障后进入机体血液，引起机体激烈的免疫炎症反应，可能导致动物个体的死亡。

2.4 热应激对肠道微生物屏障的影响 肠道存在一个由肠道共生菌与宿主形成的微生态空间结构，良好的菌群平衡能够促进肠道生长发育，增强肠道消化吸收功能，抵御外来病原菌的黏附和定植，对肠道发挥正常生理功能至关重要。李永洙课题组[26,43-44]利用16S rDNA的PCR-DGGE 技术研究鸡的肠道菌群结构，发现热应激影响了空肠、回肠等部位菌群结构和多样性，乳杆菌等有益菌的生长受到抑制，但促进了卵形拟杆菌等有害菌的繁殖。这和彭骞骞等[45]利用相同技术分析热应激鸡盲肠菌群结构的研究结论一致。但是肠道微生物数量庞大，结构复杂，而16S rDNA 的PCR-DGGE 技术在分析高丰度菌群时定量不准、分析低丰度菌时分辨率有限，近年来飞速发展的测序技术可以克服这一不足，利用测序技术分析热应激畜禽肠道菌群变化已有相关报道。Wang 等[46]利用16S rRNA 测序技术分析热应激肉鸡回肠菌群结构发现，热应激导致肉鸡回肠菌群物种丰富度提高，其中梭状芽孢杆菌、链霉菌、粪杆菌、罗氏杆菌、阿利西伯菌、固氮螺菌和颤杆菌含量均有所增加，而粪球菌和链球菌含量降低。Zhu 等[47]利用宏基因组测度技术发现，热应激导致蛋鸡的粪便菌群中，厚壁菌门数量显著降低，拟杆菌门数量升高，且进一步的功能预测发现，热应激导致与半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯甲酸盐降解等相关代谢途径更丰富，而降低了视黄醇代谢和苯丙烷生物合成等代谢途径，这些改变都是造成肠道代谢紊乱的原因。Dinan 等[48]认为应激可能通过迷走神经使丘脑-垂体-肾上腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis，HPA）和肠道微生物产生互作，改变肠道微生物组成，进而影响肠道结构和功能。综上，热应激会严重影响畜禽肠道的菌群结构和多样性，同时破坏肠道结构。

但是外界环境温热信号如何改变肠道菌群进而影响肠道结构和功能？目前比较主流的观点认为微生物主要是通过其代谢产物如短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）影响宿主肠道健康。SCFAs 是由未被胃和前肠分解的非淀粉多糖、抗性淀粉、低聚糖、糖醇等碳水化合物经后肠解糖细菌发酵生成的，主要是乙酸、丙酸、丁酸。产短链脂肪酸菌主要包括肠杆菌、拟杆菌属、双歧杆菌属、雷普沃氏菌属、嗜酸乳杆菌、霍氏真杆菌等，详细参见Ara Koh 等[49]的综述。SCFAs 是结肠细胞的主要能源物质，直接为肠道细胞提供能量。SCFAs 还可以降低肠道pH，抑制有害病原菌生长。并且SCFAs 可通过激活AMPK 信号通路保护肠道的紧密连接结构，维持细胞骨架形态，保护肠道屏障功能，提高跨膜电阻值，降低肠道的渗透性[50-51]。因此，热应激可能通过影响产SCFAs 菌属活性，降低肠道SCFAs 的浓度，影响肠道完整性。热应激影响了哪些产SCFAs 菌，有待进一步研究。

目前有关畜禽热应激肠道菌群的研究主要集中在鸡上，对其他畜禽的研究还鲜有报道，且已有报道也主要是集中在前肠段菌群，而对菌群丰富的后肠段（盲肠、结肠）部位的菌群研究非常有限，肠道菌群随着热应激时间长短的动态变化也未见报道，这几个方面都可以作为畜禽热应激进一步研究的方向。

3 小 结

综上所述，热应激导致畜禽体温升高，采食降低，损害畜禽肠道的消化吸收功能，并导致肠道屏障功能紊乱，严重损害畜禽的肠道健康。近年国内外有关热应激影响畜禽肠道健康的研究主要集中在对肠道形态结构、肠道完整性的损伤及机制的探讨，而对热应激条件下化学屏障变化、肠道菌群变化、脑-肠-菌互作、中枢调控和肠道内分泌互作的影响等还未见深入的报道。机体是一个复杂的有机整体，多层面结合探讨热应激的分子机制可作为下一步的研究方向。