自噬调控因子mTOR对心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究进展

韩利民，罗小红，赵海龙*

1遵义医科大学基础医学院病理生理学教研室，贵州遵义 563000；2重庆市长寿区人民医院病理科，重庆 401220

缺血性心脏病已成为我国居民死亡的第二大病因，临床上采用经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)可有效地改善心肌灌注，是降低患者病死率的重要措施[1]。 但心肌缺血后血流再灌注常会对心肌产生二次损伤，该过程被称为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。据统计，美国每年约有66万人因初发急性心肌梗死死亡，约30万人因再发心肌梗死死亡[2]。探索更多治疗PCI术后心肌I/R损伤的策略仍然是现阶段亟待解决的问题之一。

自噬是细胞通过单层或双层膜包裹待降解物形成自噬体，然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体，并进行多种酶消化及降解的过程[3-4]。多项证据表明，自噬参与了心肌I/R损伤过程，自噬不足或过度均是引起心肌I/R损伤的重要原因，但其具体机制尚不完全清楚[5-7]。哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的重要调控因子，已被证实与肿瘤、神经系统疾病、代谢性疾病及心血管疾病等多种疾病息息相关[8-14]。近年来，有关心肌I/R损伤的体内及体外研究表明，多种药物均可通过mTOR调控自噬，从而在一定程度上改善心肌I/R损伤[6,15-18]。本文对mTOR在心肌I/R损伤中的研究进展进行综述，旨在明确自噬调控因子mTOR改善心肌I/R损伤的相关作用机制，以期为治疗心肌I/R相关药物的研发提供依据。

1 mTOR简介

1.1 mTOR的结构 mTOR是哺乳动物中雷帕霉素的直接靶点，属于磷脂酰肌醇-3激酶相关激酶(phosphatidylinositol-3-kinase PI3K related protein kinase，PIKK)家族成员。mTOR结构包括氨基端20个串联重复序列，羧基端的蛋白激酶结构域，以及位于激酶上游的FRB、FAT两个结构域和下游的FATC结构域[19]。mTOR与不同适配器蛋白结合可形成mTORC1及mTORC2两种复合物。其中，mTOR调控蛋白(regulatory protein associated with mTOR，raptor)是mTORC1的核心元件之一，主要负责底物的募集；mLST8是其另一个核心元件，可激活激酶结构域；40 ku大小的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白(proline-rich AKT substrate 40，PRAS40)、DEP结构域含有雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白(DEP domain-containing mTOR interacting protein，deptor)与raptor作用，发挥负向调节mTORC1的功 能[20]。而mTORC2的活性区域是mTOR的雷帕霉素不敏感伴侣(rapamycin-insensitive companion of mTOR，rictor)，其功能是与底物结合；protor 1/2、mSin1通过与rictor结合以维持mTORC2的稳定及活化[21]。

1.2 mTOR的生物学功能 mTOR是细胞生长发育的关键因子，在维持机体正常的生物学功能中起重要作用。Potter等[22]的研究证实，采用不同剂量的mTOR抑制剂雷帕霉素喂食果蝇幼虫可导致其出现行为缺陷及发育迟缓。Sciarretta等[20]研究发现，mTOR基因敲除(mTOR-KO)的新生小鼠心肌细胞发育不良，在出生3周后可迅速出现扩张型心肌病导致死亡。p70S6K是mTOR的下游基因，可控制细胞生长、增殖及分化等过程，mTOR可直接促使其磷酸化，从而使p70S6K激活[23]。同时，mTOR也可激活真核起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4G)，并抑制4EBP1/2增强mRNA转录，促进蛋白质合成[24]。此外，mTOR还可直接激活胆固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)，同时间接抑制Lipin1的表达，进而促进脂质合成[25]。

2 mTOR对自噬过程的影响及其调控机制

自噬过程通过溶酶体对非功能性蛋白进行降解，可促使营养物质被机体重新利用，因此曾被看作是机体在各种应激条件下(如缺血、缺氧等)的一种自我保护反应[26]。mTOR是自噬的重要负性调控因子，可通过抑制自噬复合物ULK-ATG13-FIP200形成，从而抑制自噬过程的激活[27]。AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR是调控自噬的两条重要信号通路，前者在能量不足时被激活，而后者在感受到胰岛素等生长因子后被激活。Zeng等[28]发现，在心肌缺血阶段，AMPK/mTOR信号通路被激活，电镜下可观察到心肌细胞自噬小体数量明显增加。Wang等[29]发现，与正常大鼠相比，糖尿病性脑病大鼠模型中PI3k/AKT/mTOR信号增加，使自噬水平下降。由此可见，不同条件下mTOR介导的自噬在维持机体的稳态中均发挥着重要作用。

3 mTOR对心肌缺血及再灌注阶段的不同作用及其机制

自噬在心肌I/R损伤中具有双重作用，适度自噬可促进细胞存活，而过度自噬则会引起细胞发生自噬性死亡。mTOR在不同阶段可通过不同机制调控自噬水平，减轻心肌细胞的损害。

3.1 mTOR在心肌缺血阶段的作用及机制 Lin等[15]研究发现，在心肌缺血阶段，mTOR因能量不足及缺氧被抑制，从而激活自噬过程，促进心肌细胞存活。AMPK/mTOR是该过程诱导自噬激活的主要通路，心肌能量不足时，AMP/ATP上升，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)也被激活，两者可直接激活结节性硬化复合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)，抑制下游mTOR蛋白的表达。此外，还有其他机制参与抑制mTOR：①心肌能量不足及缺氧可分别激活p38调节活化蛋白激酶(p38-regulated/activated kinase，PRAK)、B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kD protein-interacting protein 3，BNIP3)，导致Rheb(脑中富含的Ras同源蛋白)失去结合GTP的能力，阻断mTOR的激活[30]； ②心肌缺氧诱导产生的缺氧诱导因子α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-α)激活发育及DNA损伤调节基因1(regulated in DNA damage and development 1，REDD1)后通过TSC1/2间接抑制mTOR[20](图1)。

3.2 mTOR在再灌注阶段的作用及机制 Shi等[5]发现，再灌注阶段心肌细胞自噬水平明显升高，其原因与Beclin 1的激活有关，而与AMPK/mTOR无关。具体机制如下：①该过程产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)通过ROS-JNK信号通路干扰Beclin 1/Bcl-2的相互作用，使Beclin 1从Bcl-2中游离出来，从而促进自噬的发生[31]；②该过程的Ca2+超载促使钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)在Ser90位点直接磷酸化Beclin 1，促进K63连接的Beclin 1泛素化并激活自噬[32]。以上机制最终使心肌细胞发生过度自噬，导致细胞死亡。此时，mTOR因血流恢复及炎性因子被激活，在一定程度上可抑制过度自噬，抵抗心肌I/R损伤。一方面，心肌血流恢复后，PI3K/AKT信号通路在激素、生长因子等的刺激下被激活，PRAS40对mTOR的抑制作用解除，同时还能抑制TSC1/2间接激活mTOR，最终抑制自噬过程。另一方面，大量ROS可触发炎症反应，通过IKKβ/NF-κB信号通路抑制TSC1/2，最终导致mTOR被激活，从而抑制自噬[33](图1)。Zeng等[28]发现，在心肌I/R阶段，与对照组相比，西红花苷处理可明显减少心肌细胞凋亡，电镜下心肌细胞自噬小体的数量明显减少，其机制与AKT/mTOR信号通路激活有关。

4 基于mTOR的相关信号通路与心肌I/R损伤

mTOR作为自噬的重要调控因子，越来越多的证据表明，多种药物可作用于mTOR相关信号通路，调控不恰当的自噬水平，从而改善心肌I/R损伤，mTOR可能是治疗心肌I/R损伤的潜在靶点。

4.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路与心肌I/R损伤 PI3K/AKT/mTOR是一种调控自噬的经典信号通路，与心血管疾病密切相关。Lin等[34]研究证实，促红细胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽(helix B surface peptide，HBSP)可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路减轻心肌I/R诱导的过度自噬及细胞凋亡。Zhang等[35]发现，远程缺血后处理在体内及体外均有对抗心肌I/R损伤的心脏保护作用，其机制与PI3K/mTOR信号通路上调乙醛脱氢酶2(ALDH2)的表达有关。此外，多项研究表明，多种药物均可通过作用于PI3K/AKT/mTOR信号通路而抑制细胞过度自噬，在一定程度上减轻心肌I/R损伤(表1)。

图1 mTOR对心肌缺血再灌注损伤的作用机制Fig.1 Mechanism of mTOR in myocardial ischemia-reperfusion injury

4.2 AMPK/mTOR信号通路与心肌I/R损伤AMPK是mTOR的上游抑制因子，对能量不足尤为敏感。Fu等[6]的研究表明，与对照组相比，天麻素预处理可通过增加自噬通量(p62蛋白水平下降、LC3Ⅱ蛋白水平增高)减轻小鼠心肌I/R损伤，其机制与p-AMPK升高及p-mTOR降低有关；加入AMPK特异性抑制剂后小鼠心肌自噬水平降低，心功能恶化，表现为左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短分数(left ventricular fraction shortening，LVFS)均明显下降。Yang等[7]发现，一种分泌型脂肪因子丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)可依赖AMPK/mTOR的激活而上调自噬通量，抑制心肌细胞凋亡，而使用氯喹抑制自噬通量后则降低了vaspin的保护作用。此外，一项临床研究证实，对PCI术后患者予以黄连素治疗后，血浆C反应蛋白(CRP)、TNF-α及IL-6水平较对照组均明显降低，考虑与AMPK/mTOR激活有关[36]。综上，AMPK/mTOR信号通路激活可提高细胞自噬水平，从而改善心肌I/R损伤。

表1 mTOR与心肌I/R损伤的相关研究Tab.1 Related researches on mTOR and myocardial I/R injury

4.3 其他mTOR信号通路与心肌I/R损伤 除PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR两条重要信号通路外，还存在其他mTOR通路与心肌I/R损伤有关。Zhang等[17]发现，右美托咪定可减轻大鼠I/R后的心肌细胞凋亡、氧化应激及炎性反应，其机制与SIRT1/mTOR信号通路激活有关。Li等[46]研究证实，骨髓间充质干细胞衍生的条件培养基可通过激活Notch2/mTOR信号通路降低H9C2细胞缺氧/复氧后的自噬水平，增强H9C2细胞活力，并减少ROS的产生。

5 总结与展望

目前临床上对于PCI术后血流再灌注引起的心肌I/R损伤并无特效药物，主要是对其机制进行干预。自噬调控因子mTOR在改善心肌I/R损伤中发挥重要作用。心肌缺血阶段，AMPK/mTOR通路的激活可增强自噬，促进心肌细胞存活；而再灌注阶段，PI3K/AKT/mTOR通路的激活可通过抑制过度自噬而减少心肌细胞死亡。因此，PCI术后使用药物或其他方式激活mTOR可能是预防及治疗心肌I/R 损伤的策略之一。此外，基于mTOR在心肌缺血阶段的作用机制，对于仅合并轻度心肌缺血暂无PCI手术指征的大部分临床患者，是否可通过抑制mTOR途径减少缺血对心肌细胞的损伤尚需进一步探讨。